一氧化碳中毒遲發(fā)性腦損害的分子機制研究.pdf

1、研究目的: 一氧化碳（Carbon monoxide，CO）為無色、無臭、無刺激性的氣體，在水中的溶解度甚低，空氣混合爆炸極限為12．5％～74％。凡含碳的物質(zhì)燃燒不完全時，都可產(chǎn)生一氧化碳，因此一氧化碳的來源廣泛，如家庭用煤爐、燃氣熱水器和汽車發(fā)動機廢氣為一氧化碳常見的來源。工業(yè)生產(chǎn)中接觸一氧化碳的作業(yè)則不下70余種，如冶金工業(yè)中煉焦、煉鐵、鍛冶、鑄造和熱處理的生產(chǎn)；化學工業(yè)中合成氨、丙酮、光氣、甲醇的生產(chǎn)；礦井放炮、煤礦瓦斯

2、爆炸事故等過程，或生產(chǎn)使用含一氧化碳的可燃氣體。炸藥或火藥爆炸后的氣體含一氧化碳約30％～60％。上述工業(yè)生產(chǎn)過程中都可能有接觸一氧化碳的機會，但職業(yè)性急性一氧化碳中毒多發(fā)生于一氧化碳泄漏同時通風不良的情況下。由于一氧化碳無色無臭，泄露后不易及時發(fā)覺，急性一氧化碳中毒迄今是我國發(fā)病和死亡人數(shù)最多的急性職業(yè)中毒。一氧化碳也是許多國家包括我國北方在內(nèi)的意外生活性中毒中致死人數(shù)最多的毒物。 CO中毒可以造成以中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能損害為主

3、的多臟器病變，其中CO中毒遲發(fā)性腦病是最常見且嚴重的并發(fā)癥，發(fā)病率約為0．2％-47．3％，在重度CO中毒患者中可達10％-40％。部分急性一氧化碳中毒的患者，在急性期昏迷蘇醒后癥狀完全恢復，經(jīng)歷2～30天的假愈期后再次出現(xiàn)記憶力障礙、遺忘癥候群、帕金森綜合征、舞蹈征、失語、失用、皮質(zhì)盲、癲癇發(fā)作、幻覺、精神異常等表現(xiàn)，臨床表現(xiàn)主要以癡呆為主，被稱為“一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病”。更多患者有輕微神經(jīng)精神缺陷包括人格異常和認知障礙。輕度認知障

4、礙的發(fā)生率可高達67％，縱使經(jīng)過高壓氧治療后也有18％的中毒者遺留有神經(jīng)精神癥狀。由于一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病病程較長，治療困難，患者常遺留有認知功能和記憶障礙等，嚴重影響生活質(zhì)量，并給社會帶來了巨大負擔，成為目前臨床醫(yī)學的重大難題。國內(nèi)外已經(jīng)有很多學者對遲發(fā)性腦病的機制進行了研究，目前有很多假說譬如免疫反應或凋亡的存在可能參與了遲發(fā)型腦損害的發(fā)生，但遲發(fā)性腦病的確切的發(fā)病機制迄今尚未闡明。 研究方法: Wistar雄性

5、成年大鼠144只，應用腹腔染毒的方法制造一氧化碳中毒模型，選擇染毒前和染毒后1天、3天、7天、14天和28天時間點進行觀察。用99．9％的一氧化碳氣體進行腹腔注射，共4次，每隔4小時一次，首次劑量為100ml/Kg，其余3次劑量減半為50ml/Kg。每個時間點觀察大鼠的臨床表現(xiàn)，并行大鼠被動回避性跳臺實驗，記錄跳臺潛伏期和錯誤次數(shù)。生物化學方法測定血清和組織勻漿丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）含量、抗活性氧活力（anti-ROS）、

6、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽還原酶（GR）；免疫組織化學染色方法觀察大腦皮質(zhì)和海馬是否存在細胞凋亡或/和壞死的形態(tài)學變化；用Western Blotting方法分析大腦皮質(zhì)和海馬中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白以及線粒體蛋白細胞色素C、神經(jīng)絲蛋白（NF-H，NF-M，NF-L）含量的變化；末端脫氧核糖核苷酰轉(zhuǎn)移酶（TdT）介導的標記脫氧脲核苷酸缺口末端標記法，進行凋亡細胞的檢測；DNA裂解的檢測是

7、通過瓊脂糖凝膠電泳測定大腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)組織提取的DNA是否存在DNA Ladder。 結(jié)果: 1．動物模型的建立 腹腔染毒后5分鐘，動物即出現(xiàn)明顯的中毒反應，表現(xiàn)為拒食少動，行動遲緩，抽動，煩躁不安，肢端皮膚和粘膜呈明顯的櫻桃紅色，部分大鼠出現(xiàn)角弓反張，震顫，繼而昏迷等癥狀，給予通風，約7-8小時后大鼠完全蘇醒，觀察到第28天，大鼠的飲食和日?；顒訜o明顯異常。跳臺實驗測定中毒后大鼠不同時間點的記憶力的變化（包括

8、跳臺潛伏期和錯誤次數(shù)的記錄）。 2．跳臺實驗結(jié)果顯示，與染毒前相比，染毒后大鼠記憶力明顯減退，表現(xiàn)為跳臺潛伏期縮短，錯誤次數(shù)增加，于染毒后第3天、7天、14天、28天最明顯（P<0．05）。 3．大鼠大腦皮質(zhì)、海馬和血清中氧化抗氧化系統(tǒng)的改變 3．1大腦皮質(zhì)：中毒后，MDA的含量呈現(xiàn)一個先升高后降低的趨勢。與染毒前相比，在染毒后第3天、7天、14天和28天分別升高了176％，140％，125％和113％?？够钚匝?/p>

9、活力在第7天、14天和28天時有明顯的下降；GSH-Px和GR在染毒后呈現(xiàn)一個緩和的下降趨勢； GSH在染毒后先升高而后漸下降138％，103％，69％，63％， and65％。 3．2海馬：MDA的含量呈現(xiàn)一個先升高后降低的趨勢。與染毒前相比，染毒后第1天、3天、7天、14天和28天MDA的含量分別升高了150％，136％，127％，121％和109％。活性氧在第28天時較染毒前降低19％（P<0．05）； GSH-Px和GR

10、在染毒后第3天時分別下降14％和22％；抗活性氧能力在第28天時較染毒前降低22％（P<0．05）； GSH的含量于第1天時先升高而后分別下降97％，75％，71％，and71％。 3．3血清：與染毒前相比，在染毒后第1天，3天，7天，14天和28天，血清MDA分別增加了162％，134％，125％，120％ and108％（P<0．05）?？够钚匝趸盍υ诘?8天時較染毒前降低10％（P<0．05）； GSH-Px和GR染毒后在

11、血清中呈逐漸下降的趨勢。GSH在血清中的變化趨勢與大腦皮質(zhì)和海馬相同。 4．免疫組織化學染色結(jié)果 免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)Bcl-2在染毒后第14天和28天時大鼠大腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元胞漿和核周的表達明顯下降。 與對照組相比，Bax在大腦皮質(zhì)和海馬中的表達于染毒后第7天和第14天時明顯的升高，于第28天稍有下降。 Caspase-3在大腦皮質(zhì)和海馬中于第14天和第28天時在胞漿的表達比較明顯。 5．染

12、毒后大鼠腦組織凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3和線粒體蛋白Cyt-C、含量的改變。 5．1中毒大鼠腦組織中細胞凋亡相關(guān)蛋白含量的時間變化趨勢 5．1．1 Bcl-2：大腦皮質(zhì)：與染毒前相比，大腦皮質(zhì)中Bcl-2的表達呈逐漸增加的趨勢，分別增加28％，37％，44％，75％，and77％（p<0．01）；在海馬中的表達而是逐漸下降的，22％，50％，59％，67％，and70％（p<0．01）。

13、5．1．2 Bax：在大腦皮質(zhì)中分別增加30％，49％，55％，61％，and62％；在海馬中32％，49％，47％，54％，and52％。 5．1．3 Caspase-3：在大腦皮質(zhì)中13％，64％，65％，90％，and89％；在海馬中6％，25％，27％，56％，and58％。 5．2中毒后大鼠腦組織中線粒體蛋白含量的時間變化趨勢 Cyt-c：與對照組相比，大腦皮質(zhì)中染毒后第1天和第3天分別下降了16％，

14、43％，而后于第7天、14天和28天分別增加了42％，46％，133％。海馬中與對照組相比，與染毒后第1天、3天和7天分別下降了39％，47％，20％，而后于第14天和28天分別增加了4％和20％。 6．染毒后大鼠神經(jīng)組織NF蛋白含量的改變 7． TUNEL檢測 光鏡下可見DNaseⅠ降解處理后的陽性對照和實驗組，大腦皮質(zhì)和海馬中的細胞核呈圓形和不規(guī)則形，棕染，著色深，細胞界限不清，表明一氧化碳中毒后神經(jīng)元出現(xiàn)D

15、NA的斷裂，并伴有3'-OH形成。 8．核DNA的瓊脂糖凝膠電泳 中毒后大鼠大腦皮質(zhì)和海馬DNA沒有觀察到典型的180-200bp的DNALadder，梯狀條帶不明顯，這種陰性結(jié)果并不能排除有凋亡的存在，只表明DNA的損傷相對較輕，還不至于出現(xiàn)DNA Ladder。 結(jié)論: 1．一氧化碳中毒后有記憶障礙的發(fā)生，可能與遲發(fā)性腦組織損害有關(guān)。 2．一氧化碳中毒引起的氧化抗氧化系統(tǒng)的失衡在遲發(fā)性腦損害中