基于提高對肝腫瘤治療效果的載蘿卜硫素和甲苯磺酸索拉菲尼介孔二氧化硅納米脂質(zhì)體的體內(nèi)外研究.pdf

1、肝臟腫瘤是全球第五大常見癌癥和引起死亡的第三大疾病。肝臟腫瘤在我國發(fā)病率越來越高，化療中的多藥耐藥導(dǎo)致的高復(fù)發(fā)率使患者難以長期生存，對于不能手術(shù)治療的中晚期患者，目前還沒有有效的治療手段。近年來大量事實(shí)證明肝腫瘤是由肝腫瘤干細(xì)胞(LCSC)所引發(fā)，肝腫瘤干細(xì)胞對常規(guī)化療藥物的耐藥性和放射療法不敏感，治療后殘余的腫瘤干細(xì)胞會分化增殖，因此，肝腫瘤干細(xì)胞在肝腫瘤治療和復(fù)發(fā)中起著關(guān)鍵性作用。要想達(dá)到根治肝腫瘤的的目的，需要同時(shí)徹底清除肝腫瘤細(xì)

2、胞和肝腫瘤干細(xì)胞。
　　蘿卜硫素（1-異硫氰酸-4-甲磺?；⊥椋⑽拿鸖ulforaphane，SFN），在西蘭花、甘藍(lán)、蘿卜等十字花科類植物中含量較高，能夠抑制Ⅰ相P450細(xì)胞色素酶，誘導(dǎo)Ⅱ相金屬還原酶，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯和凋亡，可選擇性作用于多種腫瘤干細(xì)胞。甲苯磺酸索拉菲尼（4-{4-[3-（4-氯-3-三氟甲基苯基）酰脲]苯氧基}吡啶-2-甲酰胺對甲苯磺酸鹽，英文名Sorafenib tosylate，ST）是一種多靶點(diǎn)的口

3、服抑制劑，能抑制VEGFR、PDGFR、KIT等受體酪氨酸激酶活性，還可以抑制RAF激酶活性，既可作用于腫瘤細(xì)胞又可作用于腫瘤血管，能夠顯著改善晚期肝腫瘤患者的生存狀態(tài)，是目前臨床上肝腫瘤治療的一線藥物。
　　為了達(dá)到同時(shí)殺傷肝腫瘤普通細(xì)胞和肝腫瘤干細(xì)胞的目的，本課題設(shè)計(jì)了載蘿卜硫素介孔二氧化硅納米脂質(zhì)體(SFN/MSN/LIPs)和載甲苯磺酸索拉菲尼介孔二氧化硅納米脂質(zhì)體(ST/MSN/LIPs)。
　　借助高效液相色譜技

4、術(shù)建立了蘿卜硫素和甲苯磺酸索拉菲尼的含量測定方法。蘿卜硫素的線性方程為:A=40，238，415C+57，864(R2=0.9993)，線性范圍為:2.52～161.50μg·mL-1。甲苯磺酸索拉菲尼的特異性良好，線性方程為:A=88885C+45916(R2=0.999)，線性范圍為:1.96～125.38μg·mL-1。經(jīng)考察，蘿卜硫素和甲苯磺酸索拉菲尼的體外HPLC測定方法的特異性、線性相關(guān)性、準(zhǔn)確度、精密度均符合體外測定要求，

5、可用于蘿卜硫素和甲苯磺酸索拉菲尼的體外含量測定，為蘿卜硫素和甲苯磺酸索拉菲尼在藥劑學(xué)實(shí)驗(yàn)中包封率、載藥量以及體外釋放度的測定建立了良好的基礎(chǔ)。
　　在已有文獻(xiàn)研究和課題組前期工作的基礎(chǔ)上，制備了介孔二氧化硅納米粒。通過降低分散介質(zhì)的pH，減少了納米粒子的聚集，再借助超聲破碎儀或微射流超高壓納米均質(zhì)機(jī)將納米粒分散細(xì)化，提高了體系的穩(wěn)定性，使納米粒子的氨基化更均勻。納米粒經(jīng)氨基化后，在中性條件下就能保持很好的分散性，為下一步制備pH響

6、應(yīng)型的載體系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)。
　　采用激光納米粒度測定儀，掃描電子顯微鏡(SEM)，透射電子顯微鏡(TEM)對載體介孔結(jié)構(gòu)、分散狀況、表面形態(tài)、粒徑分布、Zeta電位等性質(zhì)進(jìn)行表征。采用氮?dú)馕?脫附法對載體的比表面積、孔徑和孔容積進(jìn)行了考察。結(jié)果表明:
　　(1)采用表面活性劑模板法(Surfactant Template Method)制備的介孔二氧化硅納米粒，粒徑在100nm左右，粒徑均一性好，呈球形，BET多點(diǎn)比表面積為

7、709.24m2·g-1，BJH吸附累積總孔體積為0.71 cm3·g-1，BJH吸附平均孔徑為4.69nm，且具有較窄的孔徑分布。
　　(2)對MSN表面用AEPTMS進(jìn)行氨基化修飾，制備了氨基化的MSN(MSN-NH2)，在不改變介孔結(jié)構(gòu)的前提下，改善了MSN的分散性，
　　(3)將載藥的MSN包裹于由二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)及膽固醇(Cholesterol)共同組成的pH敏感脂質(zhì)體中

8、，利用了pH敏感脂質(zhì)體的特性，在中性條件下，羧基質(zhì)子化，磷脂材料的立體形狀呈倒置圓錐體，（即親水段大而親油端小），彌補(bǔ)了DOPE的立體缺陷（立體結(jié)構(gòu)呈圓錐狀，但親水端小而親油端大），形成穩(wěn)定的脂質(zhì)雙分子層膜，在酸性條件下，羧基質(zhì)子化，親水端體積變小，失去對DOPE的補(bǔ)缺作用，類生物膜結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定，最終與生物膜融合而釋放藥物。從而實(shí)現(xiàn)對腫瘤的靶向治療作用。
　　(4)通過采用透析管方式考察載體對藥物在不同pH條件下的釋放行為，來推

9、測載體在體內(nèi)可能出現(xiàn)的釋放情況。結(jié)果表明，藥物的釋放具pH依賴性，在pH=7.4（生理?xiàng)l件）下，藥物釋放相對較慢，而在pH=5.0（腫瘤內(nèi)環(huán)境）條件下，釋放速度加快，且趨于完全釋放，這有助于發(fā)揮藥物對腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞的殺傷作用。
　　在課題組已有研究工作的基礎(chǔ)上，本文采用無血清懸浮培養(yǎng)技術(shù)，成功篩選分離出HepG2微球體，作為研究肝腫瘤干細(xì)胞的模型。在此基礎(chǔ)上，考察了蘿卜硫素和甲苯磺酸索拉菲尼對肝腫瘤細(xì)胞HepG2細(xì)胞系和肝腫

10、瘤干細(xì)胞HepG2微球體的殺傷作用，并進(jìn)一步考察了對肝腫瘤干細(xì)胞HepG2細(xì)胞系和HepG2微球體的聯(lián)合殺傷作用。結(jié)果表明:
　　(1)對HepG2細(xì)胞系，當(dāng)蘿卜硫素和甲苯磺酸索拉菲尼摩爾比例為1∶5、1∶10、1∶20時(shí)，聯(lián)合作用指數(shù)CI值小于1，均表現(xiàn)為協(xié)同作用;兩藥比例為20∶1、10∶1、5∶1、1∶1時(shí)，在低濃度時(shí)聯(lián)合作用指數(shù)CI值小于1，表現(xiàn)為協(xié)同作用，而在高濃度時(shí)聯(lián)合作用指數(shù)CI值大于1，表現(xiàn)為拮抗作用。
　　

11、(2)對HepG2微球體，當(dāng)蘿卜硫素和甲苯磺酸索拉菲尼摩爾比例為5∶1、1∶1、10∶1、20∶1時(shí)，在低濃度時(shí)聯(lián)合作用指數(shù)CI值小于1，表現(xiàn)為協(xié)同作用，而在高濃度時(shí)聯(lián)合作用指數(shù)CI值大于1，表現(xiàn)為拮抗作用;當(dāng)兩藥比例為1∶5、1∶10、1∶20時(shí)，聯(lián)合作用指數(shù)CI均小于1，表現(xiàn)為協(xié)同作用。
　　由于SFN毒性作用較低，最終優(yōu)選出二者的給藥比例為1∶5（在此比例下對HepG2細(xì)胞系和HepG2-MS均具有協(xié)同作用）。為處方設(shè)計(jì)和后

12、續(xù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供了依據(jù)。
　　借助流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡考察了肝腫瘤細(xì)胞對介孔二氧化硅納米脂質(zhì)體的攝取。從流式細(xì)胞儀測定結(jié)果可以看出，空白載體(MSN/LIPs)組的熒光強(qiáng)度較未處理組細(xì)胞無顯著性差異，蘿卜硫素和甲苯磺酸索拉菲尼(SFN+ST)聯(lián)用組和SFN/MSN/LIPs+ST/MSN/LIPs組的熒光值顯著高于未處理組，SFN/MSN/LIPs+ST/MSN/LIPs組的熒光值又顯著高于SFN+ST組，說明SFN/MSN

13、/LIPs+ST/MSN/LIPs組中進(jìn)入HepG2細(xì)胞的藥物量高于SFN+ST組，說明載體對肝癌HepG2細(xì)胞和HepG2微球體均具有一定靶向性。激光共聚焦顯微鏡直觀觀察肝腫瘤細(xì)胞與介孔二氧化硅納米脂質(zhì)體的作用過程。結(jié)果表明，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞的作用下，載體可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部并完成藥物釋放，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞靶向給藥。介孔二氧化硅納米脂質(zhì)體對肝腫瘤細(xì)胞具有一定的靶向性。實(shí)驗(yàn)還考察了載蘿卜硫素介孔二氧化硅納米脂質(zhì)體(SFN/MSN/LIPs)和載甲苯磺

14、酸索拉菲尼介孔二氧化硅納米脂質(zhì)體(ST/MSN/LIPs)以優(yōu)選比例給藥，對肝腫瘤HepG2細(xì)胞和HepG2微球體的殺傷作用。結(jié)果顯示，與二者游離藥物以優(yōu)選比例給藥相比，作用有顯著性差異(p＜0.05)。說明納米載體對肝腫瘤HepG2細(xì)胞和HepG2微球體具有一定靶向性。
　　建立了人肝腫瘤HepG2細(xì)胞裸鼠移植模型，在此基礎(chǔ)上，以裸鼠腫瘤體積變化曲線、體重改變、腫瘤的重量差異、腫瘤抑制率、離體腫瘤細(xì)胞再培養(yǎng)微球體成球率等為指標(biāo)考

15、察了載藥介孔二氧化硅納米脂質(zhì)體在動物體內(nèi)的抗腫瘤效果。體內(nèi)抗腫瘤活性評價(jià)結(jié)果表明，空白藥物載體MSN/LIPs組與生理鹽水組相比，無顯著性差異(p＞0.05);體重變化率均無體重下降現(xiàn)象，說明MSN/LIPs及載藥MSN/LIPs用于治療肝腫瘤無明顯的毒副作用，可用于肝腫瘤的治療。甲苯磺酸索拉菲尼介孔二氧化硅納米脂質(zhì)體組(ST/M SN/LIPs)及載蘿卜硫素介孔二氧化硅納米脂質(zhì)和載甲苯磺酸索拉菲尼介孔二氧化硅納米脂質(zhì)體聯(lián)用組(SFN/

16、MSN/LIPs+ST/MSN/LIPs)，與其他組相比，具有顯著性差異(p＜0.05)，說明藥物聯(lián)用優(yōu)于藥物單獨(dú)使用，更優(yōu)于兩種游離藥物的聯(lián)用和單獨(dú)使用，提示載荷藥物的介孔二氧化硅納米脂質(zhì)體聯(lián)用通過高載藥量、pH敏感釋放和納米尺度的EPR效應(yīng)可同時(shí)提高對體內(nèi)腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞的殺傷作用。裸鼠體內(nèi)抗肝癌干細(xì)胞活性研究的結(jié)果表明，藥物處理組與生理鹽水組相比，微球體的直徑偏小，微球體形成率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)，說明SFN和ST對肝

17、腫瘤干細(xì)胞均有作用;載體聯(lián)用組與游離藥物聯(lián)用組相比，微球體形成率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)，說明SFN和ST經(jīng)MSN/LIPs包載后，可以同時(shí)作用于肝腫瘤細(xì)胞和肝腫瘤干細(xì)胞，增強(qiáng)了體內(nèi)抗腫瘤活性。
　　綜上所述，本課題研究設(shè)計(jì)的載蘿卜硫素介孔二氧化硅納米脂質(zhì)體和載甲苯磺酸索拉菲尼介孔二氧化硅納米脂質(zhì)體載體系統(tǒng)與其它納米給藥系統(tǒng)相比可以提高對兩種藥物載藥量，提高藥物的穩(wěn)定性和分散性。SFN/MSN/LIPs與ST/MSN/LIPs