載索拉非尼及蘿卜硫素介孔二氧化硅脂質(zhì)納米粒聯(lián)用體外抗腫瘤細(xì)胞與腫瘤干細(xì)胞作用研究.pdf

1、本課題首先研究索拉菲尼(SO)與蘿卜硫素(SF)單獨(dú)及聯(lián)合用藥對(duì)肝腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞的治療效果，然后制備載SO和SF的脂質(zhì)雙分子層的介孔二氧化硅納米粒(LMSN)，進(jìn)一步探討載SO和SF的LMSN單獨(dú)及聯(lián)合用藥對(duì)肝腫瘤細(xì)胞HepG2的治療效果。
　　我們首先借助于高效液相色譜技術(shù)建立了SO和SF含量測(cè)定的方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SO濃度在12.5～400μg·mL-1范圍內(nèi)與樣品峰面積A呈良好相關(guān)性(r=0.9999)，直線回歸方程

2、:A=10061C-203.8。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SF濃度在3.125～200μg·mL-1范圍內(nèi)與樣品峰面積A呈良好相關(guān)性(r=0.9999)，直線回歸方程:A=31321 C+44464。結(jié)果顯示，SO與SF方法的線性、精密度、回收率、專屬性均符合要求，可以用于藥物的含量檢測(cè)。
　　在溫和堿性條件下，以CTAB陽(yáng)離子表面活性劑作為模板劑，TEOS作為無(wú)機(jī)硅源，在80℃介孔合成溫度條件下，制備二維結(jié)構(gòu)相的MCM-41型MSN。使用硅

3、烷偶聯(lián)劑AEPTMS對(duì)MSN進(jìn)行表面氨基化修飾，制備得到的Ap-MSN分散性顯著得到改善，孔徑增大至9.97nm，孔容積為0.724cm3/g，并增加了對(duì)SF的載藥量。采用乙醇注入法，以DOPC，DOPE，DSPE-PEG2000，膽固醇為油相，制備了粒徑均一、在透射電鏡(TEM)下清晰可見(jiàn)核殼結(jié)構(gòu)的的脂質(zhì)體(Liposome)，然后將Liposome與載藥MSN共孵育，成功制備了具有脂質(zhì)雙分子層的載藥納米粒(LMSN)。掃描電鏡(SE

4、M)下觀察MSN形貌，大小圓整，粒徑在90～100nm之間。MSN的TEM圖譜表示介孔結(jié)構(gòu)有序、均一是典型的二維結(jié)構(gòu)相MCM-41型介孔分子篩結(jié)構(gòu)。
　　采用CCK-8法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞活性，結(jié)果表明SO和SF對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)呈濃度依賴性。通過(guò)比較SO與SF在7種不同摩爾比例，每個(gè)比例篩選6種不同濃度，利用協(xié)同指數(shù)CI值（CI＞1.1，拮抗;0.9＜CI＜1.1，相加;CI＜0.9，協(xié)同），篩選出對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的

5、協(xié)同、拮抗及相加比例分別為5∶1、1∶1、10∶1。通過(guò)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)對(duì)不同比例細(xì)胞克隆形成情況進(jìn)行考察，結(jié)果表明SO與SF在協(xié)同比例5∶1，SO與SF濃度分別是4、0.8μmol/L時(shí)其克隆形成數(shù)(14.7±3.08)明顯低于拮抗比例1∶1，SO與SF濃度分別是4、4μmol/L時(shí)的克隆形成數(shù)(31.33±5.16)，P＜0.01;細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SO與SF主要抑制HepG2細(xì)胞早期凋亡，在SO與SF在協(xié)同比例5∶1時(shí)，SO與

6、SF濃度分別是8、1.6μmol/L時(shí)其早期凋亡率（18.9±3.87）％明顯高于拮抗比例1∶1，兩藥濃度分別是8、8μmol/L時(shí)的早期凋亡率（4.76±0.06）％。
　　選用人肝腫瘤細(xì)胞株HepG2，用無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)得到HepG2-TS。以CD133作為肝腫瘤干細(xì)胞特異性表面標(biāo)記物，經(jīng)流式細(xì)胞儀證實(shí)肝腫瘤微球體高表達(dá)CD133。采用CCK-8法檢測(cè)SO與SF對(duì)HepG2-TS的細(xì)胞殺傷效果，結(jié)果表明∶在相同濃度下，SO

7、與SF對(duì)HepG2-TS比對(duì)HepG2細(xì)胞系的IC50低，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相比HepG2細(xì)胞系而言，HepG2-TS對(duì)SO與SF更為敏感;微球體成球率實(shí)驗(yàn)表明:經(jīng)SO與SF處理后，微球體成球率均比空白組下降，而紫杉醇對(duì)照組的微球體成球率高于空白組，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:SO與SF對(duì)肝腫瘤干細(xì)胞殺傷作用更強(qiáng)。我們進(jìn)一步計(jì)算不同比例不同濃度下SO與SF對(duì)HepG2-TS的協(xié)同指數(shù)CI值，結(jié)果表明:SO與SF比例為20∶1時(shí)表現(xiàn)為協(xié)同作用(CI＜0

8、.9)，5∶1時(shí)表現(xiàn)為相加作用(0.9＜CI＜1.1)。
　　在載藥納米粒體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，空白材料MSN與LMSN在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)HepG2細(xì)胞均無(wú)細(xì)胞毒性。SF/LMSN比SF的細(xì)胞殺傷作用更強(qiáng)，SO/LMSN和SO的細(xì)胞殺傷作用相比沒(méi)有顯著性差異。在SO/LMSN∶SF/LMSN摩爾比為5∶1時(shí)比單獨(dú)使用SO/LMSN或SF/LMSN具有更強(qiáng)的殺傷效果。
　　本課題采用模板法成功制備MSN，其粒徑均一、表面形貌圓整

9、、具有清晰有序的二維孔道結(jié)構(gòu)。采用HPLC法分析MSN的載藥量及包封率，結(jié)果表明以MSN為納米載藥系統(tǒng)可顯著提高對(duì)疏水藥物SO的包封率和載藥量;氨基化改性后可提高SF藥物的載藥量及包封率。課題首次比較SO與SF在不同摩爾比時(shí)對(duì)HepG2細(xì)胞系及HepG2-TS的殺傷效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)SO與SF摩爾比為5∶1時(shí)對(duì)HepG2細(xì)胞系具有協(xié)同治療效果，對(duì)HepG2-TS具有相加治療效果，目前還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。SO/LMSN與SF/LMSN在5∶