載介孔二氧化硅納米囊脂質(zhì)體可視化增強(qiáng)HIFU消融腫瘤效力.pdf

1、本研究擬采用脂質(zhì)體包載 (Mesoporous SilicaNanocapusles，MSN)，制備一種診療一體化的新型納米顆粒——載介孔二氧化硅納米囊脂質(zhì)體(MSN-LIPO)，MSN內(nèi)部含有少量高沸點(diǎn)且易揮發(fā)的乙酸異戊酯，作為HIFU增效的空化核心，MSN殼層含有Fe3O4，作為MRIT2加權(quán)造影成像因子，并在細(xì)胞水平和活體動(dòng)物水平驗(yàn)證MSN-LIPO提高HIFU影像引導(dǎo)和增強(qiáng)HIFU消融效能的特性。
　　第一部分 載介孔二氧

2、化硅納米囊脂質(zhì)體的制備及性能檢測
　　目的：制備載介孔二氧化硅納米囊脂質(zhì)體(MSN-LIPO)和空白脂質(zhì)體(B-LIPO)，并檢測其粒徑大小、結(jié)構(gòu)特征、穩(wěn)定性、細(xì)胞攝取、生物相容性等特性。
　　方法：采用薄膜水化法制備MSN-LIPO和B-LIPO，用納米粒度及電位分析儀檢測MSN-LIPO和B-LIPO的粒徑大小及Zeta電位，用透射電子顯微鏡檢測MSN-LIPO的結(jié)構(gòu)特征，連續(xù)4周測量MSN-LIPO粒徑驗(yàn)證其穩(wěn)定性，使

3、用激光共聚焦顯微鏡及分選型流式細(xì)胞儀驗(yàn)證U87 MG人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞對MSN-LIPO的攝取，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)評估MSN-LIPO的生物相容性。
　　結(jié)果：制備的MSN-LIPO外觀呈鐵銹色，B-LIPO外觀呈淺乳白色，納米粒度及電位分析儀測得兩者的粒徑大小分別為（128.6±2.11）nm和（86.9±0.59）nm，Zeta電位分別約為（-22.9±0.77）mV和（-22.7±0.20）mV。透射電鏡顯示，脂質(zhì)體成功包載MSN顆

4、粒，粒徑與納米粒度及電位分析儀測得結(jié)果相近。連續(xù)4周測量MSN-LIPO的粒徑大小，組間比較F=0.378，P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明MSN-LIPO具有良好的穩(wěn)定性。激光共聚焦顯微鏡顯示U87 MG惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞能夠成功攝取MSN-LIPO，并呈現(xiàn)良好的時(shí)間依賴性，不同時(shí)間分組組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=675.81，P＜0.05);SNK-q多重比較顯示，30min組與0min組相比，攝取量增加(q=8.90，P＜0.05

5、);1h組與30min組相比，攝取量增加(q=2.43，P＜0.05);2h組與1h組相比，攝取量增加(q=19.77，P＜0.05);6h組與2h組相比，攝取量增加(q=14.05，P＜0.05)。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示，不同濃度MSN-LIPO對U87 MG惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞、MCF-7人乳腺癌細(xì)胞和SK-BR-3人乳腺癌細(xì)胞均沒有顯著毒性作用，剩余細(xì)胞活性均在85％以上，表現(xiàn)出良好的生物相容性。
　　結(jié)論：本研究成功制備了MSN-LI

6、PO，其粒徑較小，具有良好的穩(wěn)定性，容易被U87 MG惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞攝取，并具有良好的生物相容性。
　　第二部分 載介孔二氧化硅納米囊脂質(zhì)體增強(qiáng)磁共振T2加權(quán)成像實(shí)驗(yàn)
　　目的：檢測MSN-LIPO的磁特性，驗(yàn)證其增強(qiáng)磁共振T2加權(quán)成像的功能，探索其作為HIFU造影劑的應(yīng)用價(jià)值。
　　方法：制備MRI體外成像模型，應(yīng)用磁共振掃描儀對不同濃度的MSN-LIPO進(jìn)行磁共振成像，檢測MSN-LIPO的磁特性;建立BALB/c

7、裸鼠皮下惡性膠質(zhì)瘤模型，經(jīng)尾靜脈注射MSN-LIPO前后，進(jìn)行肝實(shí)質(zhì)掃描;在腫瘤部位局部注射MSN-LIPO前后，進(jìn)行腫瘤磁共振成像;經(jīng)尾靜脈注射MSN-LIPO前后，對腫瘤部位進(jìn)行磁共振成像。
　　結(jié)果：體外MRI成像模型顯示，MSN-LIPO具有MRI T2加權(quán)負(fù)增強(qiáng)功能，隨著MSN-LIPO的濃度增高，MRI信號強(qiáng)度逐漸降低，繪出弛豫率曲線，r2=413.7mM-1·s-1;BALB/c裸鼠惡性膠質(zhì)瘤模型磁共振成像顯示，靜脈

8、注射MSN-LIPO前，肝實(shí)質(zhì)的信號強(qiáng)度為91.84±14.41，注射后5min，肝實(shí)質(zhì)信號強(qiáng)度為30.34±2.61，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，t=7.27，P＜0.05，兩者的信號強(qiáng)度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明靜脈注射MSN-LIPO后，肝實(shí)質(zhì)信號強(qiáng)度顯著下降;腫瘤局部注射MSN-LIPO前，腫瘤信號強(qiáng)度為211.44±5.34，注射后5min，腫瘤信號強(qiáng)度為15.34±1.24，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，t=36.38，P＜0.05，兩

9、者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明腫瘤局部注射MSN-LIPO后信號強(qiáng)度顯著降低;尾靜脈注射MSN-LIPO前，腫瘤部位信號強(qiáng)度為235.99±5.17，注射后30min，腫瘤部位信號強(qiáng)度為179±4.35，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，t=14.34，P＜0.05，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明靜脈注射MSN-LIPO后，腫瘤部位信號也會(huì)顯著降低。
　　結(jié)論：本研究制備的MSN-LIPO具有良好的MRI T2加權(quán)造影功能。
　　第三部分

10、載介孔二氧化硅納米囊脂質(zhì)體增強(qiáng)HIFU消融腫效力驗(yàn)證
　　目的：驗(yàn)證在體外細(xì)胞培養(yǎng)條件下，MSN-LIPO增強(qiáng)HIFU對腫瘤細(xì)胞的殺傷效力;驗(yàn)證BALB/c裸鼠惡性膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型中，MSN-LIPO增強(qiáng)HIFU對皮下瘤的消融效力，探索其作為HIFU增敏劑的應(yīng)用價(jià)值。
　　方法：分別將MSN-LIPO和B-LIPO經(jīng)HIFU輻照后，于顯微鏡下觀察微氣泡形成情況。選取U87MG惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞作為研究對象，在體外細(xì)胞培養(yǎng)條件下，采

11、用不同HIFU參數(shù)進(jìn)行輻照，采用CCK-8試劑檢測剩余細(xì)胞活性，為下一步實(shí)驗(yàn)選取最佳HIFU參數(shù)。確定體外HIFU治療參數(shù)后，將細(xì)胞治療分4各組:(1)Control組，(2)單純HIFU組，(4) HIFU+B-LIPO組(4) HIFU+MSN-LIPO組，經(jīng)不同處理后，通過CCK-8試劑檢測各組細(xì)胞增殖活性，并用分選型流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡和壞死情況。在體內(nèi)水平的研究中，取35只BALB/c裸鼠惡性膠質(zhì)瘤模型，設(shè)立Contro

12、l組5只，治療組每組5只，治療分組為:180V、5s參數(shù)下，HIFU組、HIFU+B-LIPO組、HIFU+MSN-LIPO組;220V、5s參數(shù)下，HIFU組、HIFU+B-LIPO組、HIFU+MSN-LIPO組。取Control組裸鼠和180V、5s條件下HIFU治療的各組裸鼠，用VEVO2100超聲實(shí)時(shí)分子影像系統(tǒng)檢測治療后的血流灌注情況。最后將各治療組裸鼠處死，取出腫瘤，通過TTC染色觀察各組HIFU消融情況，并計(jì)算出消融體積

13、。
　　結(jié)果：MSN-LIPO經(jīng)HIFU輻照后，在顯微鏡下可見微氣泡產(chǎn)生，而B-LIPO經(jīng)過輻照后未見微氣泡產(chǎn)生。體外細(xì)胞培養(yǎng)條件下，HIFU參數(shù)為40V、1min時(shí)剩余細(xì)胞活性為70％左右，選定為后續(xù)治療參數(shù)。體外細(xì)胞治療分組，以對照組的剩余細(xì)胞活性為100％，單純HIFU組剩余活性約為70％，HIFU+B-LIPO組剩余活性為約72％，HIFU+MSN-LIPO組剩余活性約為52％，采用單因素方差分析，F(xiàn)=193.7，P＜0.

14、05，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用SNK檢驗(yàn)，HIFU+MSN-LIPO組與單純HIFU組相比，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，Control組凋亡和壞死細(xì)胞比例占1.61％，單純HIFU組凋亡和壞死細(xì)胞比例占20.37％，HIFU+B-LIPO組凋亡和壞死細(xì)胞比例占23.45％，HIFU+MSN-LIPO組凋亡和壞死細(xì)胞比例占42.86％，采用單因素方差分析，F(xiàn)=332.37，P＜0.05，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

15、意義，采用SNK檢驗(yàn)，HIFU+MSN-LIPO組與單純HIFU組相比，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在BALB/c裸鼠惡性膠質(zhì)瘤模型的治療中，超聲造影評價(jià)各組HIFU消融效力的結(jié)果顯示，Control組綠色信號較多，血流灌注比較豐富;HIFU組和HIFU+B-LIPO組的綠色信號相對于Control組有所減少，血流灌注降低;而HIFU+MSN-LIPO組的綠色信號明顯減少，表明MSN-LIPO增強(qiáng)了HIFU對腫瘤的消融效力，使腫瘤

16、局部血流灌注明顯減少。TTC染色顯示，在HIFU參數(shù)為180V、5s時(shí)，HIFU組的消融體積為(232.73±19.77)mm3，HIFU+B-LIPO組的消融體積為(238.46±20)mm3，HIFU+MSN-LIPO組的消融體積為（771.75±19.33）mm3，采用單因素方差分析，F(xiàn)=1234.09，P＜0.05，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用SNK檢驗(yàn)，HIFU+MSN-LIPO組的消融體積與單純HIFU和HIFU+B-LIP

17、O組相比，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在HIFU參數(shù)為220V、5s時(shí)，單純HIFU的消融體積為(325.13±29.44)mm3，HIFU+ B-LIPO組的消融體積為（343.91±29.91）mm3，HIFU+MSN-LIPO組的消融體積為（1474.88±59.8）mm3，采用單因素方差分析，F(xiàn)=1218.12，P＜0.05，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用SNK檢驗(yàn)，HIFU+MSN-LIPO組的消融體積與單純HIFU組、H

18、IFU+ B-LIPO組相比，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而180V、5s條件下HIFU+MSN-LIPO組的消融體積與220V、5s條件下單純HIFU組相比，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，t=28.349，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明在HIFU的治療中引入MSN-LIPO后，可以以更低的超聲強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)更好的消融效果。
　　結(jié)論：本研究制備的MSN-LIPO可以在體外細(xì)胞培養(yǎng)條件下，以及體內(nèi)荷瘤模型中，表現(xiàn)出增強(qiáng)HIFU消融效力的