活性熒光染料定量檢測體內(nèi)外腫瘤細(xì)胞增殖和分離細(xì)胞亞群.pdf

1、目的：
　　腫瘤異質(zhì)性一直是腫瘤治療中存在的重要挑戰(zhàn)，同一腫瘤中可以存在許多不同基因型或亞型的細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移以及對治療的敏感性等方面產(chǎn)生差異。關(guān)于腫瘤異質(zhì)性產(chǎn)生的機(jī)制，得到多數(shù)人認(rèn)可的主要是克隆進(jìn)化學(xué)說和腫瘤干細(xì)胞學(xué)說。越來越多的證據(jù)表明，只有一小部分細(xì)胞負(fù)責(zé)腫瘤的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移和對化療耐藥，這部分細(xì)胞被稱為腫瘤干細(xì)胞(cancerstem cell，CSC)。為了研究具有不同增殖和分化能力的腫瘤干細(xì)胞，我

2、們首先要優(yōu)化檢測細(xì)胞增殖的方法。測定體內(nèi)外細(xì)胞增殖的方法有很多，但這些方法無疑只能檢測較窄時間窗內(nèi)體外培養(yǎng)細(xì)胞的分裂，或追蹤最近分裂的細(xì)胞，且無法對活細(xì)胞做進(jìn)一步的分子生物學(xué)分析，更不能定量檢測不同細(xì)胞亞群的增殖情況。
　　熒光染料5(6)-羧基二乙酸熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE)目前已廣泛應(yīng)用于示蹤體內(nèi)外細(xì)胞的分裂、轉(zhuǎn)移和定位。CFSE可與胞內(nèi)蛋白不可逆結(jié)合，并隨著每一次細(xì)胞分裂CFSE標(biāo)記的熒光平均分配到兩個子代細(xì)胞中。CFS

3、E標(biāo)記的細(xì)胞在熒光衰減至接近自發(fā)熒光前可被檢測到多達(dá)8次的細(xì)胞分裂，在體內(nèi)標(biāo)記中，也可觀察長達(dá)數(shù)周時間。然后，CFSE標(biāo)記的其中一個弊端是，CFSE在一定程度上有細(xì)胞毒性且抑制細(xì)胞增殖，雖然降低CFSE濃度能盡量避免其細(xì)胞毒性，然而卻會減少其可檢測的細(xì)胞分裂次數(shù)。
　　在本研究中，我們描述了一種利用細(xì)胞膜熒光染料DiO/DiD來示蹤腫瘤細(xì)胞并定量檢測體內(nèi)外腫瘤細(xì)胞分裂次數(shù)的新方法。DiO/DiD屬于長鏈羰花青熒光染料，是一種親脂性

4、膜染料，它在水溶液中熒光極弱，然而當(dāng)用稀釋的染液標(biāo)記細(xì)胞時，DiO/DiD中的烷基鏈嵌入細(xì)胞膜的磷脂雙份子層中，并激發(fā)出強(qiáng)烈的綠色/紅色熒光。用于示蹤細(xì)胞增殖時，隨著細(xì)胞的每一次分裂，膜染料DiO/DiD的熒光能準(zhǔn)確地平分到兩個子代細(xì)胞上。DiO/DiD染料具有低熒光變異性、良好的標(biāo)記穩(wěn)定性、低細(xì)胞毒性以及極少發(fā)生細(xì)胞間轉(zhuǎn)移這些優(yōu)點(diǎn)，此外，DiO/DiD并不影響標(biāo)記細(xì)胞及后代細(xì)胞的增殖，并能通過建立細(xì)胞分裂標(biāo)準(zhǔn)曲線定量檢測體內(nèi)外細(xì)胞分裂

5、情況。鑒于DiO/DiD染料的這些特性，本課題組探究了DiO/DiD標(biāo)記體內(nèi)外培養(yǎng)細(xì)胞的可行性，檢測了DiO/DiD標(biāo)記細(xì)胞的分群情況，并結(jié)合CD133抗原分子的表達(dá)分析腫瘤細(xì)胞耐藥性。
　　利用本文中建立的DiO/DiD標(biāo)記腫瘤細(xì)胞定量檢測細(xì)胞增殖的方法，我們還探究了肝脂肪酶(hepatic lipase)及CD133在HepG2肝癌細(xì)胞化療耐藥中的作用。在本課題組的前期研究中，針對肝脂肪酶(LIPC)基因構(gòu)建EGFP-shRN

6、A干擾慢病毒載體，轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞并篩選穩(wěn)定表達(dá)株，發(fā)現(xiàn)下調(diào)LIPC后HepG2細(xì)胞增殖顯著減慢，克隆形成顯著減少，且CD133陽性細(xì)胞百分比亦顯著下降，對阿霉素、5-fu化療產(chǎn)生抵抗。本研究利用DiO/DiD標(biāo)記細(xì)胞的方法進(jìn)一步探討LIPC、CD133與腫瘤細(xì)胞增殖和化療的關(guān)系。
　　方法：
　　1.細(xì)胞膜熒光染料DiO/DiD的研究，包括其細(xì)胞毒性及標(biāo)記穩(wěn)定性。
　　1.1 MTT法檢測細(xì)胞膜熒光染料染色后細(xì)胞的

7、增殖。分別檢測Lovo細(xì)胞、SW480細(xì)胞、SW620細(xì)胞、CT26細(xì)胞以及HepG2細(xì)胞的增殖情況。
　　1.2流式細(xì)胞術(shù)檢測DiO/DiD標(biāo)記的穩(wěn)定性。
　　1.2.1 體外培養(yǎng):將DiO標(biāo)記的人HepG2細(xì)胞與未標(biāo)記的小鼠CT26細(xì)胞以1∶1的比例共培養(yǎng)1周，然后用Percp-EPCAM抗人抗體染色后，上流式細(xì)胞儀檢測。該方法原理:EPCAM抗體為抗人抗體，因此HepG2細(xì)胞高表達(dá)EPCAM，而CT26為小鼠細(xì)胞，不表

8、達(dá)EPCAM，因此利用EPCAM和DiO/DiD雙染色可以檢測細(xì)胞膜染料在細(xì)胞之間是否發(fā)生轉(zhuǎn)移。
　　1.2.2 體內(nèi)培養(yǎng):收集DiD標(biāo)記的HepG2單細(xì)胞懸液并注射到BALB/c小鼠肝被膜下，并以未標(biāo)記DiD的HepG2細(xì)胞作為陰性對照，8天后分離肝內(nèi)腫瘤并制得單細(xì)胞懸液，染Percp-EPCAM抗人抗體后流式檢測。
　　2.建立定量檢測體內(nèi)外腫瘤細(xì)胞增殖的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
　　方法原理:研究表明DiO染料的熒光強(qiáng)度在一定

9、時間內(nèi)并沒有發(fā)生衰減，DiO標(biāo)記細(xì)胞后隨著細(xì)胞的每一次分裂，熒光平均分配到兩個子代細(xì)胞中，因此我們可以推斷出:當(dāng)M為細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度，N為細(xì)胞數(shù)目，S為細(xì)胞分裂次數(shù)，可有以下公式成立:M初*N初=M末*N末，log2M初/M末=S=log2N末/N初，即S=log2M初-log2M末。由于M初為一可檢測固定值，因此可應(yīng)用R軟件對S和M末進(jìn)行對數(shù)曲線擬合，建立細(xì)胞分裂標(biāo)準(zhǔn)曲線。
　　3.DiO標(biāo)記方法的體內(nèi)外應(yīng)用研究。
　　3

10、.1 DiO標(biāo)記腫瘤細(xì)胞在化療后的作用。DiO標(biāo)記的HepG2細(xì)胞分別用不同濃度的阿霉素(0.1μM、0.3μM)化療10天后行流式檢測，發(fā)現(xiàn)化療后的HepG2細(xì)胞根據(jù)DiO熒光強(qiáng)度強(qiáng)弱分為兩細(xì)胞亞群，分別是DiO-Low和DiO-High細(xì)胞亞群。對細(xì)胞進(jìn)行干細(xì)胞標(biāo)志物CD133表達(dá)分析，探究CD133與腫瘤化療的關(guān)系。
　　3.2 DiO標(biāo)記用于腫瘤細(xì)胞亞群分選。用流式細(xì)胞分選技術(shù)對DiO-Low和DiO-High兩個細(xì)胞亞群

11、進(jìn)行分選，分選后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，3天后分別提取核糖體-新生肽鏈復(fù)合物中的mRNA。RNC-mRNA被認(rèn)為與蛋白質(zhì)豐度有更好的相關(guān)性，因此我們認(rèn)為提取RNC-mRNA進(jìn)行基因芯片分析有更可信的價值。用100μg/mL環(huán)己酰亞胺預(yù)處理細(xì)胞15min，37℃孵育，然后轉(zhuǎn)移至冰上，用預(yù)冷的PBS沖洗兩遍，完全吸凈PBS溶液，加入1ml細(xì)胞裂解液，冰浴30min，刮取裂解細(xì)胞產(chǎn)物，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的1.5mlEP管中。16000*g，10

12、min，4℃離心，除去細(xì)胞碎片，將裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至蔗糖溶液中。在超離心管中加入8ml預(yù)冷30％蔗糖溶液，吸取1ml離心上清液緩慢沿管壁加到蔗糖溶液表面，安裝預(yù)冷的離心管和轉(zhuǎn)子適配器，超速離心，330000*g，3h，4。℃。整個過程確保在4℃進(jìn)行以避免RNC-mRNA的降解。離心后，可看到管底透明膠狀物，小心把上清吸掉，用100-200ml Rb buffer充分重懸分離產(chǎn)物，加入1ml Trizol，輕輕吹打混勻。然后常規(guī)提取RNA，并

13、RNA電泳和分光光度計上檢測RNA濃度。
　　結(jié)果：
　　1.細(xì)胞膜熒光染料DiO/DiD對細(xì)胞增殖的影響。
　　細(xì)胞膜熒光染料DiO/DiD不影響細(xì)胞增殖。MTT試驗結(jié)果顯示染料標(biāo)記細(xì)胞在第1、2、3天的增殖與未染色細(xì)胞的增殖情況無顯著差異，說明DiO/DiD染料對細(xì)胞增殖無影響。
　　2.細(xì)胞膜熒光染料DiO/DiD標(biāo)記細(xì)胞后在體內(nèi)外培養(yǎng)狀況。
　　DiO陽性的HepG2細(xì)胞和DiO陰性的CT26細(xì)胞共

14、培養(yǎng)一周后染Percp-EPCAM抗人抗體，流式檢測結(jié)果顯示，在EPCAM陰性細(xì)胞中DiO陽性細(xì)胞所占比例很低，即在體外細(xì)胞培養(yǎng)中，DiO標(biāo)記能保持較好穩(wěn)定性，在細(xì)胞間較少發(fā)生轉(zhuǎn)移。DiD陽性的HepG2細(xì)胞注射至小鼠肝被膜下生長8天后取原位瘤并制得單細(xì)胞懸液，染EPCAM抗人抗體后流式檢測，結(jié)果提示，在EPCAM陰性細(xì)胞中DiD陽性細(xì)胞所占比例很低，即在體內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞膜熒光染料DiD亦能保持良好穩(wěn)定性。
　　3.建立DiO

15、定量檢測體內(nèi)外細(xì)胞增殖的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
　　3.1 不同血清濃度培養(yǎng)下細(xì)胞的分裂標(biāo)準(zhǔn)曲線。對細(xì)胞分裂次數(shù)及平均DiO熒光強(qiáng)度值進(jìn)行對數(shù)曲線擬合和建立擬合公式，結(jié)果分別是:Lovo:S=-1.79308log2M末+16.41884,R2=0.7871;SW480:S=-2.6156 log2M末+16.37847,R2=0.9033;HCT116: S=-2.77449log2M末+29.27126,R2=0.8867;HepG2:S

16、=-1.4299log2M末+18.82296,R2=0.9044;SW620:S=-1.71533log2M末+13.34059,R2=0.9853。
　　3.2 不同培養(yǎng)時間細(xì)胞的增殖分裂標(biāo)準(zhǔn)曲線。在時間窗內(nèi)，分別建立CT26細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的分裂標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得到:CT26: S=-1.28089log2M末+14.00148，R2=0.9941;HepG2:S=-1.0812 log2M末+11.56886，R2=0.

17、9963。結(jié)果顯示，在一定時間內(nèi)，DiO熒光強(qiáng)度的衰減并不影響定量檢測細(xì)胞分裂次數(shù)。
　　結(jié)論：
　　1.細(xì)胞膜熒光染料DiO/DiD標(biāo)記腫瘤細(xì)胞后不影響細(xì)胞增殖，且在體內(nèi)外培養(yǎng)中極少發(fā)生細(xì)胞間轉(zhuǎn)移。
　　2.通過建立DiO平均熒光強(qiáng)度和細(xì)胞分裂次數(shù)之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可定量檢測腫瘤細(xì)胞的分裂增殖，且在時間窗內(nèi)，熒光強(qiáng)度的衰減不影響其定量分析。
　　3.通過定量分析裸鼠種植瘤中腫瘤細(xì)胞的分裂次數(shù)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移瘤中細(xì)胞分裂

18、速度更快。
　　4.腫瘤細(xì)胞化療后根據(jù)DiO熒光強(qiáng)度強(qiáng)弱明顯分為兩個細(xì)胞亞群，且DiO-How細(xì)胞亞群的CD133表達(dá)增高，對化療更耐藥。
　　5.凋亡實驗進(jìn)一步驗證DiO熒光強(qiáng)度低的細(xì)胞（即分裂快的細(xì)胞）更容易發(fā)生凋亡，對化療更敏感。
　　6.基因芯片結(jié)果證實，在DiO熒光強(qiáng)度高的細(xì)胞（即分裂慢的細(xì)胞）中，促進(jìn)凋亡和增殖的相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，抗凋亡基因和干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)。
　　7.下調(diào)LIPC表達(dá)后，抑制H