ERK信號(hào)通路在高糖誘導(dǎo)的髓鞘化損傷中的作用及槲皮素、桂皮醛、水蛭素和單體組合對(duì)其影響的研究.pdf

1、目的：
　　從細(xì)胞及分子水平，探討ERK信號(hào)通路在高糖誘導(dǎo)周圍神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘損傷中的作用以及槲皮素、桂皮醛、水蛭素及單體組合的干預(yù)作用。
　　方法：
　　1.采用改良消化復(fù)合植塊法培養(yǎng)雪旺細(xì)胞(Schwann cells，SCs)，S-100免疫熒光染色法鑒定細(xì)胞純度，并比較改良消化復(fù)合植塊法與經(jīng)典植塊法、普通消化復(fù)合植塊法獲取SCs數(shù)量和純度。
　　2.分別采用CCK-8法和Hoechst染色法檢測(cè)50 mmol

2、/L(mM)、75 mM、100mM、125 mM、150 mM高糖培養(yǎng)24h、48h、72h、96h對(duì)SCs增殖和凋亡的影響。
　　3.槲皮素（Q，高中低濃度）、水蛭素(H)、桂皮醛(C)、槲皮素+水蛭素組合(QH)、槲皮素+桂皮醛組合(QC)、水蛭素+桂皮醛組合(HC)、槲皮素+水蛭素+桂皮醛組合(QHC)和10μM ERK通路抑制劑U0126分別干預(yù)50 mM高糖培養(yǎng)的SCs72h，CCK-8法檢測(cè)增殖率，免疫熒光染色法檢測(cè)

3、periaxin表達(dá)，Western Blot檢測(cè)P0、p-ERK、ERK、p-c-Jun、c-Jun、NICD的蛋白表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)P0、Krox-20、MAG、Notch1、Jagged1 mRNA表達(dá)，ELISA法檢測(cè)CNTF的分泌水平。
　　4.采用混合酶分步消化法培養(yǎng)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(dorsal root ganglion neuron，DRGn)，MAP-2免疫熒光染色鑒定DRGn純度。將純化后的SCs

4、接種在DRGn上，建立共培養(yǎng)體系。
　　5.Q（高中低濃度）、H、C、QH、QC、HC、QHC和U0126分別干預(yù)50 mM高糖培養(yǎng)的DRGn/SCs共培養(yǎng)體系7d，MBP免疫熒光染色檢測(cè)髓鞘節(jié)段的數(shù)目和長(zhǎng)度，MAG與p-ERK免疫熒光雙染檢測(cè)共培養(yǎng)體系中SCs p-ERK的表達(dá)，WesternBlot檢測(cè)p-ERK、ERK、MBP和MAG蛋白表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)MBP和MAG mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果：
　

5、　一、改良消化復(fù)合植塊法可提高獲取SCs的數(shù)量和純度
　　改良消化復(fù)合植塊法獲取的細(xì)胞數(shù)量和純度均較普通消化復(fù)合植塊法和經(jīng)典植塊法顯著提高(P＜0.01)。
　　二、不同高糖培養(yǎng)條件對(duì)SCs的損傷作用
　　72h時(shí)，與CON組比較，50mM-150mM HG組細(xì)胞增殖率均明顯降低，細(xì)胞凋亡率均顯著增加（P＜0.01），SCs的增殖率與葡萄糖濃度呈負(fù)相關(guān)(P＜0.01)，凋亡率與葡萄糖濃度呈正相關(guān)(P＜0.01)。

6、>　　三、槲皮素可抑制高糖條件下ERK通路介導(dǎo)的SCs成髓鞘損傷
　　1.槲皮素可緩解高糖對(duì)SCs增殖和分化及CNTF分泌的抑制
　　2.槲皮素可抑制高糖條件下SCs的髓鞘蛋白和mRNA表達(dá)的下調(diào)
　　3.槲皮素可抑制高糖條件下SCs ERK通路的激活和其下游髓鞘負(fù)性調(diào)控因子c-Jun和Notch通路的活化
　　四、槲皮素、水蛭素和桂皮醛單體及組合可抑制高糖條件下ERK通路介導(dǎo)的SCs成髓鞘損傷
　　1.槲

7、皮素、水蛭素和桂皮醛單體及組合可緩解高糖對(duì)SCs增殖和分化及CNTF分泌的抑制
　　與HG組相比，各干預(yù)組的細(xì)胞增殖率、periaxin陽(yáng)性細(xì)胞比例和CNTF分泌水平均升高，差異顯著(P＜0.01);與QHC組相比，QH、QC、HC組及Q3、H3、C3組均顯著降低(P＜0.01)。
　　2.槲皮素、水蛭素和桂皮醛單體及組合可抑制高糖條件下SCs的髓鞘蛋白和mRNA表達(dá)的下調(diào)
　　與HG組相比，各藥物干預(yù)組P0蛋白和P0

8、、Krox-20、MAG mRNA表達(dá)均升高，差異顯著(P＜0.01);與QHC組相比，QH、QC、HC組及Q3、H3、C3組均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。
　　3.槲皮素、水蛭素和桂皮醛單體及組合可抑制高糖條件下SCs ERK通路的激活和其下游髓鞘負(fù)性調(diào)控因子c-Jun和Notch通路的活化
　　與HG組相比，各藥物干預(yù)組ERK磷酸化水平、c-Jun磷酸化水平、NICD蛋白表達(dá)以及Notch1和J

9、agged1 mRNA表達(dá)均降低，差異顯著(P＜0.01);與QHC組相比，QC、QH、HC組及Q3、H3、C3組均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05)。
　　五、DRGn/SCs體外共培養(yǎng)可建立周圍神經(jīng)髓鞘化模型
　　MAP-2免疫熒光染色鑒定，DRGn細(xì)胞純度達(dá)97.39±0.09％，MBP免疫熒光染色顯示DRGn/SCs共培養(yǎng)體系可在體外形成髓鞘節(jié)段。
　　六、高糖不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)DRGn/SCs共培

10、養(yǎng)體系的影響
　　7d時(shí)，與CON組相比，50mM HG組MBP和MAG蛋白及mRNA表達(dá)顯著下降，ERK磷酸化水平顯著增強(qiáng)(P＜0.01)。
　　七、槲皮素可抑制高糖條件下DRGn/SCs共培養(yǎng)體系中ERK通路介導(dǎo)的髓鞘化損傷
　　1.槲皮素可抑制高糖條件下共培養(yǎng)體系髓鞘節(jié)段數(shù)目和長(zhǎng)度的下降
　　2.槲皮素可抑制高糖條件下共培養(yǎng)體系的髓鞘蛋白和mRNA表達(dá)的下調(diào)
　　3.槲皮素可抑制高糖條件下共培養(yǎng)體系E

11、RK通路的激活
　　MAG與p-ERK免疫熒光雙染檢測(cè)結(jié)果顯示，p-ERK與MAG染色陽(yáng)性的位置基本重合。與CON組相比，HG組的ERK蛋白磷酸化水平和p-ERK表達(dá)顯著升高(P＜0.01);與HG組相比，不同劑量槲皮素組與U0126組均顯著降低(P＜0.01); ERK蛋白磷酸化水平p-ERK表達(dá)與槲皮素的劑量負(fù)相關(guān)(P＜0.01)。
　　八、槲皮素、水蛭素和桂皮醛單體及組合可抑制高糖條件下DRGn/SCs共培養(yǎng)體系中ER

12、K通路介導(dǎo)的髓鞘化損傷
　　1.槲皮素、水蛭素和桂皮醛單體及組合可抑制高糖條件下共培養(yǎng)體系髓鞘節(jié)段數(shù)目和長(zhǎng)度的下降
　　與HG組相比，各藥物干預(yù)組髓鞘節(jié)段數(shù)目和長(zhǎng)度均增多，差異顯著(P＜0.01);與QHC組相比，QH、QC、HC組及Q3、H3、C3組均顯著減少(P＜0.01)。
　　2.槲皮素、水蛭素和桂皮醛單體及組合可抑制高糖條件下共培養(yǎng)體系的髓鞘蛋白和mRNA表達(dá)的下調(diào)
　　與HG組相比，各藥物干預(yù)組MBP

13、和MAG蛋白及mRNA表達(dá)均升高，差異顯著(P＜0.01);與QHC組相比，QH、QC、HC組及Q3、H3、C3組均顯著降低(P＜0.01)。
　　3.槲皮素、水蛭素和桂皮醛單體及組合可抑制高糖條件下共培養(yǎng)體系ERK通路的激活
　　MAG與p-ERK免疫熒光雙染檢測(cè)結(jié)果顯示，p-ERK與MAG染色陽(yáng)性的位置基本重合。與HG組相比，各藥物干預(yù)組ERK磷酸化水平和p-ERK表達(dá)均降低，差異顯著(P＜0.01);與QHC組相比，Q

14、H、QC、HC組及Q3、H3、C3組均顯著升高(P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1.高糖通過(guò)誘導(dǎo)SCs ERK通路激活，同時(shí)活化其下游靶點(diǎn)SCs成髓鞘負(fù)性調(diào)控因子c-Jun和Notch通路，抑制SCs的增殖和分化，降低CNTF的分泌水平，減少髓鞘相關(guān)蛋白P0的蛋白表達(dá)以及髓鞘調(diào)控基因P0、Krox-20和MAG mRNA表達(dá)，從而導(dǎo)致SCs成髓鞘損傷。
　　2.槲皮素、水蛭素、桂皮醛單體單用組、兩兩配伍組和三種單體復(fù)

15、方組能夠通過(guò)抑制高糖誘導(dǎo)的ERK通路的激活，同時(shí)阻斷其下游靶點(diǎn)c-Jun和Notch通路的活化，促進(jìn)SCs的增殖和分化，增加CNTF的分泌水平，上調(diào)P0的蛋白表達(dá)以及P0、Krox-20和MAG mRNA表達(dá)水平，從而有效緩解高糖誘導(dǎo)的SCs成髓鞘的損傷。單體之間比較，槲皮素的作用優(yōu)于水蛭素和桂皮醛。兩兩配伍組作用優(yōu)于組合中配伍的單體單用組。三種單體復(fù)方組的作用均優(yōu)于兩兩配伍組和單體單用組。
　　3.高糖通過(guò)誘導(dǎo)共培養(yǎng)體系中SCs

16、的ERK通路的激活，下調(diào)髓鞘相關(guān)蛋白MBP和MAG蛋白和mRNA表達(dá)，減少共培養(yǎng)體系形成的髓鞘節(jié)段數(shù)目和長(zhǎng)度，從而引起DRGn/SCs共培養(yǎng)體系髓鞘化的損傷。
　　4.槲皮素、水蛭素、桂皮醛單體單用組、兩兩配伍組和三種單體復(fù)方組均能通過(guò)抑制高糖條件下共培養(yǎng)體系中SCs的ERK通路的激活，提高M(jìn)BP和MAG的蛋白和mRNA表達(dá)，增加共培養(yǎng)體系形成的髓鞘節(jié)段數(shù)目和長(zhǎng)度，從而有效緩解高糖對(duì)共培養(yǎng)體系髓鞘化的損傷。槲皮素的作用優(yōu)于水蛭素和