ABCA1-ABCB1-ABCC1三條基因抗砷作用的研究.pdf

1、目的：在前期研究證實(shí)ABCA1基因具有抗砷功能的基礎(chǔ)上，本課題按析因設(shè)計(jì)的要求，利用RNA干擾技術(shù)將ABCA1基因與已明確具有抗砷作用的ABC家族ABCB1（MDR1）、ABCC1（MRP1）基因，分別采用單一基因抑制、兩個(gè)聯(lián)合抑制、和三者同時(shí)抑制的方法，通過(guò)檢測(cè)目的基因阻斷前后，抗砷細(xì)胞ECV304對(duì)急性砷毒性耐受性變化和細(xì)胞內(nèi)砷含量的改變，進(jìn)一步確定ABCA1基因的功能及其在抗砷過(guò)程中與ABCB1、ABCC1基因有否交互作用，并推測(cè)

2、可能的抗砷機(jī)制。 方法：采用析因設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)法，將化學(xué)合成的ABCA1、ABCB1、ABCC1基因的特異性siRNA在siPORTMNeoFX TM轉(zhuǎn)染劑的介導(dǎo)下，轉(zhuǎn)染抗砷細(xì)胞ECV304，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR）方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后目的基因mRNA水平；蛋白質(zhì)免疫印記法（Western-blot）檢測(cè)轉(zhuǎn)染后目的基因蛋白水平。通過(guò)CCK8法檢測(cè)48h急性砷染毒后光密度值（OD）值，計(jì)算生存率及半數(shù)抑制濃度（IC

3、50），反應(yīng)細(xì)胞抗砷性的變化，用原子熒光分光光度法（AFS）檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)砷蓄積量的變化。 結(jié)果：Real-time PCR結(jié)果顯示所有標(biāo)本的管家基因Actin和目的基因均可見(jiàn)較標(biāo)準(zhǔn)的擴(kuò)增曲線，無(wú)非特異擴(kuò)增?？股榧?xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-ABCA148小時(shí)的Real-time PCR檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中ABCA1的表達(dá)量較陰性對(duì)照組明顯降低（P<0.05），而陰性對(duì)照組與未轉(zhuǎn)染的抗砷細(xì)胞ABCA1表達(dá)量無(wú)明顯差異（P>0.05），且siR

4、NA-ABCA1濃度為80nM時(shí)的干擾效率為90.3±1.98％；同樣篩選出siRNA-ABCB1和siRNA-ABCC1干擾效率在91.2±1.03％和90.7±2.63％時(shí)的濃度分別為20nM和40nM，并認(rèn)為三者的干擾效率一致。Western-blot結(jié)果顯示抗砷細(xì)胞在轉(zhuǎn)染三條目的基因siRNA后，實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組及未轉(zhuǎn)染組在相應(yīng)目的蛋白Marker處均有特異性蛋白條帶，其大小與目的蛋白大小相符，且實(shí)驗(yàn)組相應(yīng)目的蛋白表達(dá)量明顯低

5、于陰性對(duì)照組及未轉(zhuǎn)染組。依此濃度將三對(duì)siRNA-ABCA1，siRNA-ABCB1，siRNA-ABCC1分別按析因設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)染抗砷細(xì)胞，Wetern-blot檢測(cè)相應(yīng)目的蛋白呈低表達(dá)，急性砷染毒48h用CCK8法計(jì)算生存率及IC50，經(jīng)析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在各砷濃度下生存率均低于同步對(duì)照組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。干擾ABCA1，ABCB1，ABCC1，ABCA1+ABCB1，ABCA1+ABCC1，ABCB

6、1+ABCC1，ABCA1+ABCB1+ABCC1基因后，細(xì)胞的IC50分別為（5.68±0.018，6.38±0.05，4.87±0.071，5.46±0.129，5.15±0.085，4.94±0.51，4.08±0.066）μmol/l明顯低于對(duì)照組IC50（12.2±0.08，12.08±0.35，12.14±0.74，12.23±1.2，12.03±1.92，12.15±0.57，12.07±1.48）μmol/l，并且三條基

7、因聯(lián)合抑制的抗砷細(xì)胞在各砷濃度的生存率與ECV304相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。AFS檢測(cè)結(jié)果顯示，4h，6h，8h，10h實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)砷含量均高于同步對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），三條基因同時(shí)干擾時(shí)，細(xì)胞砷含量明顯增加，并且在6，8，10小時(shí)與ECV304細(xì)胞內(nèi)砷蓄積量相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論：我們的結(jié)果表明：ABCA1、ABCB1、ABCC1三條基因均是重要抗砷基因，其主要的抗