土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯在大鼠體外代謝產(chǎn)物的提取分離及體內(nèi)外代謝產(chǎn)物的鑒定研究.pdf

1、土木香內(nèi)酯（alantolactone）和異土木香內(nèi)酯（isoalantolactone）兩個(gè)天然產(chǎn)物主要是從常用中草藥土木香（Inula Helenium）中提取得到。2010版的《中國(guó)藥典》記載土木香主要用于健脾和胃、行氣止痛、安胎。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明這兩種單體化合物具有抗菌、驅(qū)蟲、抗炎、抗腫瘤等生物活性。近年來的研究重點(diǎn)側(cè)重于其抑制癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡及抗炎的生物活性及作用機(jī)制。
　　過去，由于代謝物含量低，在分析過程

2、中往往會(huì)被復(fù)雜的內(nèi)源性物質(zhì)及背景噪聲所掩蓋，所以對(duì)體內(nèi)代謝物的鑒定工作一度進(jìn)入瓶頸期，其中不飽和度低的萜類化合物更是如此。因此，對(duì)土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯在體內(nèi)的代謝物及代謝途徑尚無系統(tǒng)的研究。在當(dāng)前的研究中，能夠觸發(fā)信息依賴采集（Information Dependent Acquisition）掃描的實(shí)時(shí)多重質(zhì)量虧損（Multiple Mass Defect Filter）和動(dòng)態(tài)背景扣除（Dynamic Background Sub

3、traction）在線技術(shù)成功地解決了這一難題。該項(xiàng)技術(shù)具有靈敏度高、分辨能力強(qiáng)的特點(diǎn)，能夠精確地測(cè)定所有可能的代謝物的分子量并根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)設(shè)置有選擇的觸發(fā)二級(jí)質(zhì)譜掃描。本實(shí)驗(yàn)采用該技術(shù)，在UPLC-Triple TOF5600+儀器上建立了一種具有普遍適用性的鑒定土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯體內(nèi)代謝物的方法，并將其應(yīng)用于給藥大鼠的尿液、膽汁、糞便及微生物轉(zhuǎn)化的代謝物檢測(cè)，根據(jù)代謝物推測(cè)可能的代謝途徑。土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯經(jīng)大鼠腸道菌溫

4、孵得到的代謝物為大鼠體內(nèi)代謝物的鑒定提供了理論依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)方法可為其它α-亞甲基-γ-內(nèi)酯類化合物的體內(nèi)代謝物的檢測(cè)提供模板依據(jù)，為土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯的體內(nèi)代謝過程和藥理作用機(jī)制的闡明奠定基礎(chǔ)。
　　目的:用UPLC-Triple TOF-MS技術(shù)結(jié)合大鼠腸道菌代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)建立一種具有普遍適用性的土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯體內(nèi)代謝物的鑒定方法，對(duì)土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯的大鼠尿液、膽汁、糞便及腸道菌轉(zhuǎn)化

5、中的代謝物進(jìn)行鑒定，并推測(cè)其代謝途徑。
　　方法:
　　1.大鼠腸道菌代謝產(chǎn)物的制備：取大鼠新鮮糞便，加到厭氧培養(yǎng)液中培養(yǎng)30 min，再分別加入二者單體化合物，于37℃培養(yǎng)48 h，用等體積乙酸乙酯萃取3次，濃縮，殘留物經(jīng)柱色譜分離所得的流份經(jīng)TLC檢驗(yàn)，相同成分合并純化后，經(jīng)半制備HPLC分離得到代謝物單體。采用HRMS、1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY、HSQC、HMBC、NOESY等波譜學(xué)方法對(duì)其化

6、學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。
　　2.大鼠體內(nèi)體外代謝物的鑒定：經(jīng)過預(yù)處理的生物樣品經(jīng)過UPLC-Triple TOF-MS方法檢測(cè)后，采用Metabolitepilot1.5中的多種數(shù)據(jù)挖掘工具（提取離子色譜、質(zhì)量虧損過濾、碎片離子過濾和中性丟失過濾）對(duì)代謝物數(shù)據(jù)進(jìn)行快速準(zhǔn)確的識(shí)別和提取。然后利用 PeakView2.0中的MasterView獲得代謝物的精確質(zhì)量數(shù)、分子式及二級(jí)質(zhì)譜圖。利用上述生物轉(zhuǎn)化所得代謝物單體作為對(duì)照品，比對(duì)其與待鑒

7、定化合物的保留時(shí)間和二級(jí)質(zhì)譜圖，確定代謝物結(jié)構(gòu)。對(duì)沒有對(duì)照品的代謝物，利用質(zhì)譜信息與Chemspider數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行推測(cè)。
　　結(jié)果：經(jīng)過UPLC-Triple TOF-MS方法檢測(cè)，腸道菌代謝和灌胃給予土木香內(nèi)酯單體的大鼠除母藥外共檢測(cè)到44個(gè)代謝產(chǎn)物，其中尿液中11個(gè)、膽汁中10個(gè)、糞便中38個(gè)、腸道菌代謝產(chǎn)物13個(gè)。腸道菌代謝和灌胃給予異土木香內(nèi)酯單體的大鼠除母藥外共檢測(cè)到46個(gè)代謝產(chǎn)物，其中尿液中10個(gè)、膽汁中

8、10個(gè)、糞便中39個(gè)、腸道菌代謝產(chǎn)物13個(gè)。其中共有44個(gè)新型含硫二聚體化合物未見報(bào)道。然而，檢測(cè)中僅發(fā)現(xiàn) AL和iAL的半胱氨酸和N-乙酰半胱氨酸結(jié)合型II相代謝產(chǎn)物。根據(jù)代謝物，對(duì)其代謝途徑進(jìn)行了推測(cè)。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用UPLC-Triple TOF-MS檢測(cè)技術(shù)，成功地發(fā)現(xiàn)和鑒定了二者在大鼠體內(nèi)的代謝物，為二者在體內(nèi)的代謝過程和藥理作用機(jī)制的闡明奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)根據(jù)二者代謝物的特點(diǎn)為其它α-亞甲基-γ-內(nèi)酯類倍半萜的體內(nèi)