槲皮素、異土木香內(nèi)酯和土木香內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)修飾研究.pdf

1、第一部分槲皮素的結(jié)構(gòu)修飾及活性評(píng)價(jià)
　　槲皮素是一種分布最廣泛的黃酮類(lèi)化合物，約有100多種植物中含有槲皮素。研究發(fā)現(xiàn)槲皮素具有廣泛的藥理作用和生物活性，如抗氧化、抗癌、抗菌、抗病毒及鎮(zhèn)痛作用等，因此對(duì)槲皮素及其衍生物的生物活性研究越來(lái)越受到關(guān)注。然而槲皮素脂溶性較差、生物利用度較低，使其開(kāi)發(fā)利用受到了限制。槲皮素-O-甲基化衍生物是在體內(nèi)代謝的中間體并被認(rèn)為是最有生物活性的結(jié)構(gòu)，所以對(duì)槲皮素進(jìn)行甲基化修飾及活性研究具有相當(dāng)重要的

2、意義。
　　目的:以槲皮素為研究對(duì)象，通過(guò)直接甲基化和先用保護(hù)基對(duì)槲皮素的羥基進(jìn)行保護(hù)，然后再甲基化兩種途徑，獲取槲皮素甲基化衍生物，用1H NMR、13C NMR、HSQC和HMBC等鑒定化合物結(jié)構(gòu)，對(duì)結(jié)構(gòu)修飾的產(chǎn)物進(jìn)行抗肝癌活性篩選，為發(fā)現(xiàn)新的藥物先導(dǎo)化合物做出一些基礎(chǔ)研究工作。
　　方法:將精制后的槲皮素和適量的DMF置于三口燒瓶中，加入適量的無(wú)水碳酸鉀，室溫?cái)嚢?0 min后加入甲基化試劑碘甲烷，在室溫或0℃反應(yīng)，T

3、LC監(jiān)測(cè)至反應(yīng)結(jié)束，用稀鹽酸將反應(yīng)液調(diào)至中性，乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)夜，旋蒸除去溶劑，殘液用硅膠柱色譜進(jìn)行分離，根據(jù)反應(yīng)溫度和反應(yīng)物投料比的不同，可得單甲基槲皮素至四甲基槲皮素。將槲皮素溶于DMF中，加入適量的無(wú)水碳酸鉀，室溫?cái)嚢?0 min后加入芐基化試劑氯化芐，60℃反應(yīng)，TLC監(jiān)測(cè)至反應(yīng)結(jié)束，用稀鹽酸將反應(yīng)液調(diào)至中性，乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)夜，旋蒸除去溶劑，殘液用硅膠柱色

4、譜進(jìn)行分離，根據(jù)反應(yīng)溫度和氯化芐用量的不同，可主要得三芐基槲皮素和四芐基槲皮素，然后再用甲基化試劑碘甲烷對(duì)芐基槲皮素分別進(jìn)行甲基化。用二氯二苯甲烷對(duì)槲皮素的鄰二酚羥基進(jìn)行保護(hù)，然后再用甲基化試劑碘甲烷對(duì)其進(jìn)行甲基化。產(chǎn)物應(yīng)用ESI-MS、1H NMR鑒定化合物的結(jié)構(gòu)、部分化合物經(jīng)13C NMR、HSQC和HMBC等鑒定結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果:不用保護(hù)基，直接用碘甲烷對(duì)槲皮素進(jìn)行甲基化，室溫條件下反應(yīng)主要得3，7，3'，4'-O-四甲基槲

5、皮素(2a)和3，7，4'-O-三甲基槲皮素(2b)，0℃反應(yīng)，主要得7，4'-O-二甲基槲皮素(2c)、3，7-O-二甲基槲皮素(2d)和3-O-甲基槲皮素(2e)。用氯化芐對(duì)槲皮素的羥基進(jìn)行保護(hù)，在70℃、氯化芐是槲皮素的5倍（摩爾數(shù)）時(shí)，主要得四芐基槲皮素(3b);在60℃、氯化芐是槲皮素的3倍（摩爾數(shù)）時(shí)，主要得三芐基槲皮素(3a);用碘甲烷分別對(duì)三芐基槲皮素和四芐基槲皮素進(jìn)行甲基化反應(yīng)，得到了三芐基甲基槲皮素(4a)，而未能得

6、到四芐基甲基槲皮素(4b)。用二氯二苯甲烷對(duì)槲皮素的鄰二酚羥基進(jìn)行保護(hù)得化合物5，由于5的收率太低，而未對(duì)其進(jìn)行甲基化反應(yīng)。
　　結(jié)論:本研究對(duì)槲皮素進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，直接用碘甲烷和槲皮素反應(yīng)，在不同的溫度及投料比條件下，共得到5個(gè)槲皮素甲基化衍生物;先將槲皮素的羥基保護(hù)起來(lái)，然后再進(jìn)行甲基反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方案和直接甲基化的實(shí)驗(yàn)方案相比，反應(yīng)步驟多，分離提純困難、收率低。抗肝癌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，槲皮素的甲基化程度越高，抗肝癌細(xì)胞（人肝癌細(xì)

7、胞株Bel-7402、人肝癌細(xì)胞株Hep G2、大鼠肝癌細(xì)胞株SMMC-7721）增殖能力越弱。
　　第二部分土木香的提取分離
　　目的:以中藥材土木香根為研究對(duì)象，利用硅膠柱色譜、硝酸銀硅膠柱色譜等分離技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分離，獲得異土木香內(nèi)酯和土木香內(nèi)酯單體化合物，用1H NMR鑒定化合物結(jié)構(gòu)，為下一步的結(jié)構(gòu)修飾奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　方法:取粉碎后的藥材約5 Kg，用99％乙醇加熱回流2小時(shí)提取3次，合并濾液，除去溶劑得浸膏

8、，即土木香根的粗提物，約600 g。將得到的土木香浸膏分散于氯化鈉飽和水溶液中，依次用石油醚、二氯甲烷進(jìn)行萃取，得石油醚提取物浸膏約135 g、二氯甲烷提取物浸膏約70 g。采用硅膠柱色譜、硝酸銀硅膠柱色譜對(duì)以上部?jī)煞N浸膏進(jìn)行分離可得異土木香內(nèi)酯和土木香內(nèi)酯兩個(gè)化合物，用1H NMR對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果:通過(guò)乙醇提取、石油醚和二氯甲烷萃取和柱色譜等步驟從土木香根中分離得到異土木香內(nèi)酯和土木香內(nèi)酯兩個(gè)化合物，為下一步的

9、結(jié)構(gòu)修飾奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　結(jié)論:本研究主要是從土木香根中提取其主要活性成分異土木香內(nèi)酯和土木香內(nèi)酯，經(jīng)過(guò)乙醇提取、石油醚和二氯甲烷萃取、柱色譜分離等步步驟可以得到異土木香內(nèi)酯和土木香內(nèi)酯。
　　第三部分異土木香內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)修飾—Heck反應(yīng)
　　目的:以異土木香內(nèi)酯為研究對(duì)象，通過(guò)Heck反應(yīng)對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，通過(guò)1H NMR數(shù)據(jù)對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。對(duì)結(jié)構(gòu)修飾的產(chǎn)物進(jìn)行抗肝癌活性篩選，為發(fā)現(xiàn)新的藥物先導(dǎo)化合物做出

10、一些基礎(chǔ)研究工作。
　　方法:在醋酸鈀和三（鄰甲苯基）膦的催化下和三乙胺的存在下，在DMF溶液中加入碘代芳烴對(duì)異土木香內(nèi)酯進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，120℃加熱反應(yīng)10-12 h，反應(yīng)完畢后用乙酸乙酯萃取，最后通過(guò)硅膠柱色譜進(jìn)行分離純化，洗脫劑為石油醚-乙酸乙酯(15:1)。用MTT法測(cè)定異土木香內(nèi)酯衍生物3a-3d對(duì)三種肝癌細(xì)胞的抑制活性。
　　結(jié)果:優(yōu)化了Heck反應(yīng)的合成條件:醋酸鈀和三（鄰甲苯基）膦是最佳的催化體系，溫度120℃

11、反應(yīng)10-12h。反應(yīng)物萃取之后用硅膠柱層析法進(jìn)行分離純化，得對(duì)氯苯異土木香內(nèi)酯(9a)、對(duì)苯異土木香內(nèi)酯(9b)、對(duì)甲苯異土木香內(nèi)酯(9c)和對(duì)甲氧基苯異土木香內(nèi)酯(9d)4個(gè)化合物，收率60-91％。
　　結(jié)論:本研究建立了用碘代芳烴對(duì)異土木香內(nèi)酯進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的方法，優(yōu)化了反應(yīng)條件。用MTT法測(cè)定異土木香內(nèi)酯衍生物9a-9d，對(duì)氯苯異土木香內(nèi)酯(9a)和對(duì)甲氧基苯異土木香內(nèi)酯(9d)對(duì)Hep G2腫瘤細(xì)胞的增殖抑制活性和紫杉醇

12、基本相同，優(yōu)于順鉑。
　　第四部分異土木香內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)修飾—Michael加成反應(yīng)
　　目的:以異土木香內(nèi)酯為研究對(duì)象，用活性亞甲基化合物通過(guò)Michael加成反應(yīng)對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，產(chǎn)物通過(guò)1H NMR、13C NMR、HRMS進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。對(duì)結(jié)構(gòu)修飾的產(chǎn)物進(jìn)行抗肝癌活性篩選，為發(fā)現(xiàn)新的藥物先導(dǎo)化合物做出一些基礎(chǔ)研究工作。
　　方法:將活性亞甲基化合物溶于乙醇中，加入適量的堿催化劑后室溫?cái)嚢?，然后再加異土木香?nèi)酯，室溫?cái)?/p>

13、拌反應(yīng)，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，反應(yīng)混合物調(diào)為中性用后乙酸乙酯萃取、然后通過(guò)硅膠柱色譜進(jìn)行純化，洗脫劑為石油醚-乙酸乙酯(15∶1)。用MTT法測(cè)定異土木香內(nèi)酯衍生物11a-11g對(duì)三種肝癌細(xì)胞（人肝癌細(xì)胞株Bel-7402、人肝癌細(xì)胞株Hep G2、大鼠肝癌細(xì)胞株SMMC-7721）的抑制活性。
　　結(jié)果:以異土木香內(nèi)酯為底物，用7種活性亞甲基化合物通過(guò)Michael加成反應(yīng)對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，共得到了7個(gè)異土木香內(nèi)酯衍生物，即氰乙酸

14、甲酯異土木香內(nèi)酯(11a)、氰乙酸乙酯異土木香內(nèi)酯(11b)、丙二酸二甲酯異土木香內(nèi)酯(11c)、丙二酸二乙酯異土木香內(nèi)酯(11d)，硝基甲烷異土木香內(nèi)酯(11e)、硝基乙烷異土木香內(nèi)酯(11f)、乙酰乙酸乙酯異土木香內(nèi)酯(11g)所有化合物經(jīng)核磁氫譜、碳譜和高分辨質(zhì)譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。以化合物11a和11c為例優(yōu)化了反應(yīng)條件，目標(biāo)化合物收率可達(dá)71～94％。
　　結(jié)論:本研究建立了用活性亞甲基化合物對(duì)異土木香內(nèi)酯進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的方法，

15、優(yōu)化了反應(yīng)條件，合成了7個(gè)未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道的化合物11a-11g。用MTT法測(cè)定合成的7個(gè)異土木香內(nèi)酯衍生物的抗肝癌活性，氰乙酸甲酯(11a)異土木香內(nèi)酯和氰乙酸乙酯異土木香內(nèi)酯(11b)對(duì)Hep G2腫瘤細(xì)胞增殖有一定的抑制作用，其抑制活性大于順鉑，小于紫杉醇。
　　第五部分土木香內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)修飾—Michael加成反應(yīng)
　　目的:以土木香內(nèi)酯為研究對(duì)象，用活性亞甲基化合物通過(guò)Michael加成反應(yīng)對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，所合成的化合

16、物通過(guò)1HNMR、13C NMR對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。
　　方法:將活性亞甲基化合物溶于乙醇中，加入適量的堿催化劑，室溫?cái)嚢瑁缓笤偌油聊鞠銉?nèi)酯，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，反應(yīng)混合物調(diào)為中性用后乙酸乙酯萃取、然后通過(guò)硅膠柱色譜進(jìn)行純化，洗脫劑為石油醚-乙酸乙酯(15:1)。
　　結(jié)果:以土木香內(nèi)酯為底物，用活性亞甲基化合物通過(guò)Michael加成反應(yīng)對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，共得到了6個(gè)土木香內(nèi)酯衍生物，即氰乙酸甲酯土木香內(nèi)