NSC23925和CD44靶向的HA-PEI-HA-PEG-MDR1 siRNA納米防治卵巢癌耐藥的研究.pdf

1、研究背景：
　　卵巢癌（ovarian cancer）死亡率位居?jì)D科惡性腫瘤之首。由于早期臨床表現(xiàn)非特異，3/4卵巢癌患者確診時(shí)已處于腫瘤晚期。初次腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)，輔以術(shù)后紫杉醇（paclitaxel，PTX）/卡鉑聯(lián)合化療是晚期卵巢癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。然而，大部分患者將最終出現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)，并伴隨出現(xiàn)對(duì)紫杉醇及其他化療藥物的耐藥，即出現(xiàn)多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）。多藥耐藥基因1（multidrug

2、resistance gene1，MDR1）及其編碼的P-糖蛋白（P-glycoprotein，Pgp）過(guò)表達(dá)是卵巢癌耐藥的主要原因之一。MDR卵巢癌細(xì)胞系和臨床腫瘤標(biāo)本均可檢測(cè)到MDR1/Pgp的過(guò)表達(dá)。腫瘤耐藥是卵巢癌化療失敗的主要原因，也是科研和臨床工作者需要攻克的難題之一。防止藥物敏感性卵巢癌產(chǎn)生耐藥和逆轉(zhuǎn)耐藥卵巢癌的耐藥性均有望攻克卵巢癌耐藥。
　　研究已證實(shí)，多種藥物可以防止腫瘤細(xì)胞在化療過(guò)程中產(chǎn)生耐藥，如：Pgp抑制

3、劑伐司撲達(dá)（Valspodar，PSC833）、比立考達(dá)（Biricodar，VX-710）和Tariquidar（XR9576）等。但是，臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示其并不能明顯改善腫瘤患者生存率。因此，我們有必要發(fā)現(xiàn)更高效和特異的藥物，以有效防止腫瘤產(chǎn)生耐藥。NSC23925是一種甲氧基苯基哌啶基小分子化合物，最近被證實(shí)為是一種選擇性、高效性的Pgp抑制劑。NSC23925通過(guò)高選擇性調(diào)節(jié)Pgp ATPase的活性，有效逆轉(zhuǎn)MDR卵巢癌體外培養(yǎng)

4、細(xì)胞和裸鼠移植瘤模型對(duì)紫杉醇的耐受性。然而，NSC23925能否有效防止藥物敏感性卵巢癌細(xì)胞在紫杉醇處理過(guò)程中產(chǎn)生耐藥還未知。
　　MDR1小干擾RNA(Small interfering RNA, siRNA)通過(guò)降低MDR1和Pgp的表達(dá)有望逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥。然而，目前在體內(nèi)將 siRNA靶向、系統(tǒng)、高效和安全運(yùn)輸至特定細(xì)胞仍存在很多障礙。近年來(lái)，納米因其獨(dú)特的物理和生物學(xué)特性成為siRNA運(yùn)輸載體領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。低分子量透明質(zhì)

5、酸（Hyaluronicacid，HA）具有生物相容性、生物可降解性、非免疫原性、無(wú)毒性、可化學(xué)修飾性，且可與耐藥卵巢癌細(xì)胞表面過(guò)表達(dá)的CD44（Cluster of differentiation44）結(jié)合，因此HA作為本課題納米載體的主要組成部分。研究已證實(shí)CD44靶向的HA為基礎(chǔ)的納米可將化療藥物或siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)。然而，透明質(zhì)酸-聚乙烯亞胺/透明質(zhì)酸-聚乙二醇（ HA-poly(ethyleneimine)/HA-poly

6、(ethylene glycol)， HA-PEI/HA-PEG）納米能否成功轉(zhuǎn)運(yùn)MDR1 siRNA并逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥還未知。因此，本課題將分為三個(gè)部分探討上述問(wèn)題。
　　第一部分 NSC23925防止體外培養(yǎng)的藥物敏感性卵巢癌細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥的研究
　　目的：
　　驗(yàn)證NSC23925能否防止體外培養(yǎng)的藥物敏感性卵巢癌細(xì)胞在紫杉醇處理過(guò)程中產(chǎn)生MDR，并探討其潛在的分子機(jī)制。
　　材料和方法：
　　為了建

7、立MDR卵巢癌細(xì)胞系，分別給予藥物敏感性卵巢癌細(xì)胞，OVCAR8和SKOV-3，濃度遞增的紫杉醇、濃度遞增的紫杉醇聯(lián)合NSC23925（紫杉醇/NSC23925）和NSC23925處理。選取不同紫杉醇處理濃度下的子代細(xì)胞系，采用MTT、Real-time PCR、蛋白印跡（Western blot）、細(xì)胞免疫熒光（immunoflunence，IF）、藥物攝取/泵出（drug uptake/efflux）實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)子代細(xì)胞對(duì)化療藥物的

8、敏感性、MDR1的表達(dá)水平及Pgp的表達(dá)水平和活性。
　　結(jié)果：
　　1. NSC23925可以防止藥物敏感性卵巢癌細(xì)胞在紫杉醇處理過(guò)程中出現(xiàn)多藥耐藥。
　?。?）紫杉醇單獨(dú)處理的OVCAR8和SKOV-3細(xì)胞最終可以在含有0.3μM紫杉醇的培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長(zhǎng)（子代細(xì)胞系標(biāo)記為OVCAR8/paclitaxel0.3和SKOV-3/paclitaxel0.3），而紫杉醇/NSC23925處理的OVCAR8和SKOV-3細(xì)

9、胞最終分別只能在含有0.006和0.001μM紫杉醇的培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長(zhǎng)（子代細(xì)胞系標(biāo)記為OVCAR8/paclitaxel0.006-NSC23925和SKOV-3/paclitaxel0.001-NSC23925）。
　?。?）與親代細(xì)胞相比，OVCAR8/paclitaxel0.3和SKOV-3/paclitaxel0.3細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性顯著降低；而OVCAR8/paclitaxel0.006-NSC23925和 SKOV

10、-3/paclitaxel0.001-NSC23925細(xì)胞始終保持對(duì)紫杉醇的敏感性。
　　（3）與親代細(xì)胞相比，OVCAR8/paclitaxel0.3細(xì)胞對(duì)多柔比星、長(zhǎng)春新堿和多西紫杉醇的敏感性顯著降低，而OVCAR8/paclitaxel0.006-NSC23925細(xì)胞保持對(duì)上述化療藥物的敏感性。
　　2.NSC23925通過(guò)阻止紫杉醇處理過(guò)程中Pgp和MDR1的過(guò)表達(dá)，從而防止藥物敏感性卵巢癌細(xì)胞產(chǎn)生MDR。與紫杉醇/

11、NSC23925處理的細(xì)胞相比，紫杉醇單獨(dú)處理的細(xì)胞最終Pgp和MDR1的表達(dá)水平顯著升高。
　　3.在紫杉醇處理過(guò)程中，聯(lián)合使用NSC23925可以通過(guò)調(diào)節(jié)Pgp的活性，保持藥物在細(xì)胞內(nèi)的蓄積水平，從而維持卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。與OVCAR8/paclitaxel0.006-NSC23925相比，OVCAR8/paclitaxel0.3細(xì)胞內(nèi) Calcein AM、Rhodamine（R123）、多柔比星和Dioc2的蓄

12、積量明顯減少，R123的泵出量明顯增多。
　　4. NSC23925單獨(dú)長(zhǎng)期處理卵巢癌細(xì)胞，對(duì)其化療藥物敏感性、Pgp的表達(dá)和活性無(wú)明顯影響。
　　小結(jié)：
　　在紫杉醇處理過(guò)程中，NSC23925可通過(guò)特異性阻止藥物敏感性卵巢癌細(xì)胞Pgp和MDR1的過(guò)表達(dá)，并保持Pgp的活性，防止其產(chǎn)生MDR。
　　第二部分NSC23925防止藥物敏感性卵巢癌裸鼠模型產(chǎn)生紫杉醇耐藥的研究
　　目的：
　　驗(yàn)證NSC2

13、3925能否防止藥物敏感性卵巢癌裸鼠模型在紫杉醇處理過(guò)程中產(chǎn)生紫杉醇耐藥，并探討其潛在的分子機(jī)制。
　　材料與方法
　　所涉及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)麻省總醫(yī)院相關(guān)部門(mén)審批（實(shí)驗(yàn)號(hào)為：2013N000121）。向3-4周的雌性裸鼠背部皮下注射大約2×106個(gè)SKOV-3細(xì)胞，首先建立藥物敏感性卵巢癌裸鼠模型。然后分別給予裸鼠長(zhǎng)周期的紫杉醇或紫杉醇/NSC23925聯(lián)合治療，以進(jìn)一步建立紫杉醇耐藥的卵巢癌裸鼠模型。治療過(guò)程中檢測(cè)裸鼠健康狀

14、態(tài)、體重和腫瘤體積。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)收集裸鼠腫瘤標(biāo)本、外周血和肝腎脾。通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)評(píng)估裸鼠腫瘤Pgp和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。通過(guò)裸鼠體量變化、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和肝腎脾的組織學(xué)形態(tài)，評(píng)估紫杉醇/NSC23925聯(lián)合治療對(duì)裸鼠的安全性。
　　結(jié)果：
　　1.建立紫杉醇耐藥的卵巢癌裸鼠模型的最適紫杉醇濃度為25 mg/kg。
　　2.NSC23925通過(guò)抑制Pgp過(guò)表達(dá)，阻止藥物敏感性卵巢癌裸鼠模型產(chǎn)生

15、紫杉醇耐藥。
　?。?）與臨床現(xiàn)象相似，紫杉醇單獨(dú)處理組在治療起始階段無(wú)腫瘤體積的增加，但是最終出現(xiàn)腫瘤體積顯著增加；而紫杉醇/NSC23925聯(lián)合治療組裸鼠在整個(gè)治療過(guò)程中腫瘤體積無(wú)明顯變化，即裸鼠始終保持對(duì)紫杉醇的敏感性，無(wú)紫杉醇耐藥的產(chǎn)生。
　?。?）大多數(shù)紫杉醇處理的腫瘤Pgp表達(dá)水平升高，而所有紫杉醇/NSC23925聯(lián)合治療的腫瘤無(wú)Pgp的過(guò)表達(dá)；紫杉醇/NSC23925聯(lián)合治療組腫瘤的Pgp表達(dá)水平顯著低于紫杉

16、醇單獨(dú)治療組（P<0.01）。
　　3.紫杉醇/NSC23925聯(lián)合治療促進(jìn)裸鼠腫瘤細(xì)胞的凋亡。紫杉醇/NSC23925治療組腫瘤的抗凋亡蛋白survivin（P<0.001），Bcl-xL（P<0.05）和MCL-1（P<0.01）的表達(dá)水平顯著低于紫杉醇單獨(dú)治療組，CD44（P<0.05）和Integrinβ3（P<0.01）的表達(dá)水平也顯著低于紫杉醇單獨(dú)組。
　　4.長(zhǎng)周期的 NSC23925單獨(dú)治療，或紫杉醇/NSC

17、23925聯(lián)合治療對(duì)裸鼠無(wú)明顯的毒副作用。在整個(gè)治療周期中，不同治療組的裸鼠體重、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和肝腎脾的組織學(xué)形態(tài)無(wú)明顯差異。
　　小結(jié)：
　　NSC23925通過(guò)抑制Pgp和抗凋亡蛋白的表達(dá)水平，防止藥物敏感性卵巢癌裸鼠模型產(chǎn)生紫杉醇耐藥。
　　第三部分裝載MDR1 siRNA的CD44靶向的HA-PEI/HA-PEG納米逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥的研究
　　目的：
　　在耐藥卵巢癌體內(nèi)外模型中驗(yàn)證CD44

18、靶向的透明質(zhì)酸-聚乙烯亞胺/透明質(zhì)酸-聚乙二醇（HA-poly(ethyleneimine)/HA-poly(ethylene glycol),HA-PEI/HA-PEG）納米能否成功轉(zhuǎn)運(yùn)MDR1 siRNA，并評(píng)估其對(duì)MDR1和Pgp表達(dá)水平的抑制作用和對(duì)腫瘤耐藥的逆轉(zhuǎn)作用。
　　材料與方法：
　　我們首先合成并鑒定 HA-PEI/HA-PEG納米，之后通過(guò)Real-time PCR、Western blot、MTT等實(shí)驗(yàn)

19、評(píng)估HA-PEI/HA-PEG/MDR1 siRNA納米對(duì)體外培養(yǎng)的耐藥卵巢癌細(xì)胞MDR1和Pgp表達(dá)水平，和紫杉醇敏感性的影響。另外，采用紫杉醇聯(lián)合HA-PEI/HA-PEG/MDR1 siRNA納米治療耐藥卵巢癌裸鼠模型，檢測(cè)其對(duì)裸鼠腫瘤體積、Pgp表達(dá)水平和凋亡水平的影響。
　　結(jié)果：
　　1.耐藥卵巢癌細(xì)胞系OVCAR8TR和SKOV-3TR，以及卵巢癌腫瘤標(biāo)本中CD44高表達(dá)。
　　2.HA-PEI/HA-P

20、EG/MDR1 siRNA納米的平均粒徑為173.3±13.7 nm，zeta電位為-22.5±0.44 mV，且在研究所需濃度下對(duì)卵巢癌細(xì)胞無(wú)明顯毒性。
　　3. HA-PEI/HA-PEG成功將MDR1 siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)至卵巢癌細(xì)胞內(nèi)，并降低細(xì)胞MDR1和Pgp的表達(dá)水平，增加化療藥物在細(xì)胞內(nèi)的蓄積水平，恢復(fù)耐藥細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性。
　　4.與對(duì)照組相比，紫杉醇聯(lián)合HA-PEI/HA-PEG/MDR1 siRNA納米治療

21、顯著抑制耐藥卵巢癌裸鼠腫瘤體積的生長(zhǎng)，并降低腫瘤 Pgp表達(dá)水平，促進(jìn)腫瘤凋亡。
　　小結(jié)：
　　CD44靶向的HA-PEI/HA-PEG納米可成功將MDR1 siRNA轉(zhuǎn)載至耐藥卵巢癌細(xì)胞，并顯著下調(diào)MDR1和Pgp的表達(dá)水平，促進(jìn)裸鼠腫瘤細(xì)胞凋亡，從而逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥。
　　結(jié)論：
　　1.NSC23925可以防止藥物敏感性卵巢癌細(xì)胞在紫杉醇處理過(guò)程中產(chǎn)生耐藥。卵巢癌患者首次化療時(shí)，聯(lián)合應(yīng)用NSC23925有望