半乳凝集素-3糖識別結(jié)構(gòu)域調(diào)控肝癌細胞功能的蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、肝癌是一種嚴重威脅人類健康的常見惡性腫瘤。根據(jù)最新的全球癌癥統(tǒng)計報告稱，2012年全球新增肝癌患者74.8萬人，同時死亡69.5萬人，新增發(fā)病率排名第六，死亡率則排名第三。目前，我國肝癌預防和診斷治療形勢仍然十分嚴峻。
　　Galectin-3是一個與HCC轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的蛋白。在健康的肝組織中，肝細胞并不表達Galectin-3，但發(fā)生癌變的肝組織中，Galectin-3的表達是明顯上調(diào)的。在肝癌細胞系中過表達Galectin-3

2、會導致細胞增殖和侵襲能力的增強。細胞內(nèi)Galectin-3主要發(fā)揮類似BCL-2家族蛋白的抗凋亡功能。在細胞外空間中，Galectin-3可以與大量的糖基化蛋白結(jié)合。依賴于Galectin-3的N端結(jié)構(gòu)域介導的寡聚作用，這些糖基化受體與Galectin-3在細胞表面形成了穩(wěn)定的晶格狀結(jié)構(gòu)，從而調(diào)節(jié)細胞的功能。
　　一種 N端結(jié)構(gòu)域缺失的Galectin-3的特殊形式僅包含了 Galectin-3的糖識別結(jié)構(gòu)域(Carbohydra

3、te recognition domain，CRD)，簡稱Gal3C，僅存在于細胞外。目前的研究發(fā)現(xiàn)， Gal3C可能在血管生成方面發(fā)揮作用，并具備一定的抑制早期腫瘤生長的作用。目前， Gal3C對HCC生長和轉(zhuǎn)移的調(diào)控機制仍然不清楚。
　　本論文針對Gal3C在HCC細胞外的功能以及其發(fā)揮功能的機制進行了研究，主要的研究目的是：1.發(fā)現(xiàn)Gal3C在HCC細胞系HepG2表面的潛在配體；2.發(fā)現(xiàn)Gal3C對表達Galectin-3

4、的HepG2細胞的生長會有何種影響；3.發(fā)現(xiàn)Gal3C發(fā)揮其調(diào)控功能的分子機制。
　　本論文結(jié)合原核共表達與光反應交聯(lián)策略、細胞生物學實驗手段以及高通量的生物質(zhì)譜依賴的定量蛋白質(zhì)組學研究策略，對 Gal3C在 HepG2細胞外表面的潛在配體、Gal3C對HepG2細胞生長遷移和增殖的影響、Gal3C對HepG2細胞的調(diào)控機制展開研究。
　　在本論文的第一部分主要研究了Gal3C在HepG2細胞表面的定位以及在細胞表面結(jié)合的潛

5、在配體。結(jié)合原核共表達策略和光反應活性代謝標記策略，表達了生物素標記的Gal3C重組蛋白Gal3CB以及生物素化/光反應亮氨酸雙重標的Gal3C重組蛋白Gal3CBP，并證明Gal3CBP具備了結(jié)合乳糖的能力。將Gal3CBP與HepG2細胞孵育，并用紫外線進行交聯(lián)，然后用FITC熒光顯色，顯示Gal3CBP主要結(jié)合在細胞表面，在細胞與細胞的連接處有聚集的趨勢。隨后用鏈霉親和素親和層析純化了交聯(lián)的細胞組分，對這些組分進行胰蛋白酶酶解、質(zhì)

6、譜檢測和Proteome Discoverer1.4數(shù)據(jù)庫搜索分析，發(fā)現(xiàn)Gal3CBP能結(jié)合細胞膜上的糖基化蛋白。這些糖蛋白有的是膜上的受體，例如：表皮生長因子受體（EGFR），轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TFR1）、胰島素樣生長因子2受體（MPRI）、六磷酸甘露糖受體(MPRD)和甘露糖受體(MRC2)。另外，溶酶體相關(guān)膜糖蛋白（LAMP2），細胞表面黏附分子如整合蛋白（Integrin）家族蛋白、基質(zhì)細胞驅(qū)動受體1（NPTN），活性白細胞黏附分子

7、（ALCAM）、神經(jīng)細胞黏附分子（L1CAM）等與細胞黏附有關(guān)的分子也是Gal3C的結(jié)合對象。
　　第一部分的研究結(jié)果顯示，通過用具有光反應交聯(lián)活性和生物素標記的Gal3CBP，并利用質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)了一些之前并未報道的Gal3C的結(jié)合組分，它們也是 Galectin-3在HepG2細胞膜表面的潛在配體。
　　本論文第二部分的研究研究了細胞外的Gal3CB對HepG2產(chǎn)生的影響。將Gal3CB添加到HepG2的培養(yǎng)體系中，然后

8、用MTT實驗分析其對HepG2生長的影響，用劃痕修復實驗和 Trans-well實驗分析其對 HepG2的生長和增殖的影響。結(jié)果顯示，細胞外過量的Gal3CB能夠抑制HepG2的生長，抑制效果隨著抑制劑量和時間的增加而增加，50μg/ml的Gal3CB處理HepG2細胞12小時，能使生長抑制率達到50％。劃痕修復結(jié)果顯示，細胞外過量的Gal3CB能夠減弱HepG2的遷移。用10μg/ml的Gal3CB處理HepG2細胞12小時后，Hep

9、G2的遷移就受到了明顯的抑制。Trans-well實驗結(jié)果顯示，細胞外的Gal3C能夠抑制HepG2細胞的侵襲能力，抑制效果隨著抑制劑量的增加而增加。
　　第二部分的研究結(jié)果顯示，如細胞外出現(xiàn)大量的Gal3C，則 HepG2的生長、遷移和侵襲都會受到一定程度的抑制。這說明，Gal3C對HCC的生長和轉(zhuǎn)移發(fā)揮負調(diào)控作用。
　　本論文第三部分的研究內(nèi)容研究了50μg/ml的Gal3CB處理HepG2細胞12小時后，細胞蛋白質(zhì)表達

10、譜的動態(tài)變化，并探討 Gal3CB對 HepG2細胞的調(diào)控機制。首先，利用13C(6)-Lysine和13（6）-Arginine對HepG2細胞進行SILAC標記，使輕重標記的細胞的相同肽段之間能夠產(chǎn)生6.03 Da的質(zhì)量差，并以此作為相對定量的基礎(chǔ)。然后，分別用Gal3C處理重標細胞或輕標細胞，并將處理前后的細胞等量混合，混合后的蛋白進行胰蛋白酶酶切和LC-MS/MS鑒定，以獲得蛋白的表達譜以及定量信息。利用在線數(shù)據(jù)分析軟件DAVI

11、D Bioinformatics Resources6.8對鑒定到的蛋白進行基因分類和信號通路分析，用IBM SPSS Statistics19對蛋白的定量信息和分布進行統(tǒng)計學分析，用在線的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)處理軟件String10對上下調(diào)的數(shù)據(jù)進行蛋白質(zhì)間的相互作用預測，以發(fā)現(xiàn)這些發(fā)生變化的蛋白之間是否存在已經(jīng)報道的或者預測的相互作用。用 WebGestalt中的Disease Association Analysis工具對這些差異表

12、達的基因進行預測，以探索它們與疾病的可能關(guān)系。用TMHMM Server v.2.0預測了差異表達蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域。分析結(jié)果顯示，在相對應的兩次正反標記實驗中，分別鑒定到肽段數(shù)為30488和29309，蛋白數(shù)為4705和4435，重復鑒定到3703個蛋白，其中，在兩次實驗中均有定量信息的蛋白有3182個。鑒定到的蛋白涉及代謝途徑、小分子代謝、蛋白質(zhì)結(jié)合以及細胞外泌體。統(tǒng)計學分析顯示，兩次實驗的均值為1.0188和1.0068，標準差為0

13、.25133和0.17903。兩次實驗的數(shù)據(jù)分布直方圖的偏度的標準誤差均為0.043，峰度的標準誤差均為0.087，兩組數(shù)據(jù)的雙側(cè)T檢驗P值＜0.01，說明數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布。兩組數(shù)據(jù)的Pearson相關(guān)系數(shù)為0.414，說明兩組數(shù)據(jù)相關(guān)性良好，符合實驗要求。
　　選擇蛋白表達量上下調(diào)范圍為均值的1.3倍，作為Gal3CB處理后，HepG2中表達出現(xiàn)變化趨勢的蛋白。在這個標準下，有35個蛋白的表達量發(fā)生了上調(diào)，67個蛋白的表達發(fā)生

14、了下調(diào)。其中，上調(diào)達到均值1.5倍的蛋白有11個，下調(diào)達到1.5倍的蛋白有24個。這些蛋白總的差異表達趨勢是，負調(diào)控細胞生長或細胞黏附的蛋白表達量是明顯上調(diào)的，正調(diào)控細胞生長或細胞黏附的蛋白的表達量是明顯下調(diào)的，符合本論文第二部分的細胞生物學結(jié)論。
　　String10分析發(fā)現(xiàn)，與GalCB存在相互作用或者可能發(fā)生相互作用的蛋白，大部分都與腫瘤生長與轉(zhuǎn)移相關(guān)。WebGestalt分析結(jié)果顯示，Gal3CB刺激下表達發(fā)生差異變化的蛋

15、白可以分為兩組。一組與代謝相關(guān)疾病存在密切關(guān)系，另一組則與腫瘤相關(guān)。NDRG1不僅與腫瘤密切相關(guān)，也肝移植有密切關(guān)系，說明其可能與肝臟腫瘤存在關(guān)系。TMHMM Server v.2.0預測結(jié)果顯示，在上調(diào)表達的蛋白中，有7個蛋白至少具有單次跨膜結(jié)構(gòu)，在下調(diào)表達的蛋白中，至少具有單次跨膜結(jié)構(gòu)的蛋白有16個，其中ALCAM是一個下調(diào)表達的跨膜蛋白，并與腫瘤密切相關(guān)。對鑒定到的差異表達蛋白進行免疫印跡驗證，結(jié)果顯示，NDRG1、CLU以及AL

16、CAM的下調(diào)表達以及S100A11、MVP和Galectin-1的上調(diào)表達均與定量蛋白質(zhì)組學的鑒定結(jié)果相符合。已有的研究證實，NDRG1、CLU以及ALCAM的下調(diào)表達以及S100A11的上調(diào)表達會導致HCC細胞生長和轉(zhuǎn)移的抑制，這與之前的研究結(jié)論相符合。同時，在這些蛋白中，NDRG1對抗腫瘤藥物達沙替尼的敏感度最大。
　　第三部分的研究結(jié)果顯示，通過研究Gal3CB處理HepG2細胞后的蛋白質(zhì)表達譜的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)了Gal3C負

17、調(diào)控細胞生長的功能可能是通過調(diào)節(jié)NDRG1、CLU、ALCAM、S100A11、MVP以及Galectin-1等的表達量實現(xiàn)的。并發(fā)現(xiàn)Gal3C抑制腫瘤細胞生長轉(zhuǎn)移的機制與達沙替尼具有一定的一致性。
　　本課題主要取得了一下創(chuàng)新性發(fā)現(xiàn)：
　　1）利用代謝標記對Gal3C進行光反應活性氨基酸標記，使之具備了光反應交聯(lián)能力，實際成為了一個研究Galectin-3配體的生物探針；
　　2）首次證實細胞外Gal3C是一個Hep

18、G2的生長和轉(zhuǎn)移的負調(diào)控因子；
　　3）發(fā)現(xiàn)并初步闡述了細胞外Gal3C抑制細胞生長和轉(zhuǎn)移的機制，細胞外Gal3C能夠調(diào)控與HepG2轉(zhuǎn)移相關(guān)的靶基因，NDRG1、CLU、ALCAM、MVP、S100A11以及Galectin-1的表達，并發(fā)現(xiàn)NDRG1對抗腫瘤藥物達沙替尼的敏感度很高；
　　4）發(fā)現(xiàn)了一組未經(jīng)報道過的Galectin-3在HCC細胞表面的潛在受體群。
　　本論文的研究結(jié)論使我們獲得了Gal3C調(diào)控HC

19、C生長和轉(zhuǎn)移機制的較為清晰的認識。細胞外Gal3C能夠結(jié)合到HepG2細胞表面，從而抑制HCC的生長和轉(zhuǎn)移。Gal3C對HepG2的生長和轉(zhuǎn)移的調(diào)控機制可能包括：1）直接影響細胞表面的粘附分子如ALCAM的表達；2）抑制細胞內(nèi)的能量代謝水平；3）調(diào)控細胞內(nèi)與生長和轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因，如 NDRG1、S100A11等的表達。
　　Gal3C對 HCC的調(diào)控是多方向，其詳細機制仍然具有深入研究的價值。本論文僅從生物學和蛋白質(zhì)組學角度，對其