凋膜止崩方對人離體EH的腺上皮細(xì)胞中COX-2與K-ras表達(dá)及增殖的影響.pdf

1、子宮內(nèi)膜增生癥病變是功能失調(diào)性子宮出血最常見的原因，也是婦科常見病，分為單純性性增生、復(fù)雜性增生和不典型增生。它的發(fā)生與子宮內(nèi)膜受雌激素持續(xù)作用而無孕酮拮抗有關(guān)，較常發(fā)生于絕經(jīng)過渡期女性，其突出的臨床癥狀為月經(jīng)異常，常表現(xiàn)為無排卵性功血，并有子宮內(nèi)膜癌變傾向。正確處理此病在子宮內(nèi)膜癌的防治上具有重要的臨床意義，一般認(rèn)為，單純性增生、復(fù)雜性增生均為良性病變，癌變率低，首選藥物治療;不典型增生患者，若年輕有生育要求，或合并嚴(yán)重的全身性疾病，

2、手術(shù)耐受性差者也可以在嚴(yán)密監(jiān)視下使用藥物治療。傳統(tǒng)的藥物治療方法是口服孕激素，對抗雌激素對子宮內(nèi)膜的刺激，逆轉(zhuǎn)過度增生的子宮內(nèi)膜，但長期口服孕激素耐受性及依從性差且存在不良反應(yīng)及停藥后易復(fù)發(fā)的問題。近些年來，一些新的藥物及技術(shù)已用于子宮內(nèi)膜增生癥的治療，并獲得了較好的治療效果。當(dāng)前，人們試圖尋找一種新的藥物供子宮內(nèi)膜增生癥治療的臨床選擇用藥。
　　凋膜止崩方表現(xiàn)出的生物學(xué)效應(yīng)提示其可能成為治療子宮內(nèi)膜增生癥的理想藥物。大量的前期實

3、驗及研究發(fā)現(xiàn)凋膜止崩方靶向應(yīng)用對大鼠子宮內(nèi)膜增生癥有明顯的祛除作用。通過壞死和凋亡兩種途徑，使增生的子宮內(nèi)膜變性、壞死、脫落，從而發(fā)揮祛膜作用，抑制異形性細(xì)胞生長，使其逆轉(zhuǎn)為正常細(xì)胞。凋膜止崩方對子.宮內(nèi)膜靶向作用明顯，有望成為治療子宮內(nèi)膜增生癥的新藥。
　　目的:通過檢測凋膜止崩方對人離體EH的腺上皮細(xì)胞中COX-2與K-ras表達(dá)，MTT法觀察細(xì)胞增殖的生物學(xué)效應(yīng)，探討其對腺上皮細(xì)胞中COX-2與K-ras表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響

4、，揭示其祛除增生子宮內(nèi)膜的機(jī)制。
　　方法:本試驗首先改良人子宮內(nèi)膜細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，原代培養(yǎng)經(jīng)病理科診斷為子宮內(nèi)膜增生癥患者的子宮內(nèi)膜，建立穩(wěn)定的原代人子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)體系;采用免疫細(xì)胞化學(xué)進(jìn)行細(xì)胞鑒定;設(shè)實驗組、對照組。原代培養(yǎng)的人子宮內(nèi)膜細(xì)胞接種培養(yǎng)3天后，細(xì)胞快速增殖進(jìn)入對數(shù)生長期，換無血清DMEM/F12培養(yǎng)液孵育24小時，使細(xì)胞同步化后隨機(jī)分為四組:A組:對照組（加入培養(yǎng)液），B組:小劑量組(給予凋膜止崩液終濃度為2

5、5ug/ml)，C組:中劑量組(給予凋膜止崩液終濃度為50ug/ml)，D組:大劑量組(給予凋膜止崩液終濃度為100ug/ml);利用該細(xì)胞培養(yǎng)體系，采用MTT法檢驗不同劑量凋膜止崩方對離體子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖活性的影響;通過RT-PCR及Western-blot方法觀察凋膜止崩方對子宮內(nèi)膜細(xì)胞中COX-2及K-ras表達(dá)的影響。
　　結(jié)果與結(jié)論:
　　1.采用膠原酶消化+二次篩網(wǎng)過濾和差速梯度離心相結(jié)合的方法進(jìn)行原代子宮內(nèi)膜細(xì)

6、胞分離培養(yǎng);利用上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的貼壁時間差別進(jìn)行純化。通過免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，證明培養(yǎng)上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞成功，其純度可達(dá)到90％和95％以上，該原代細(xì)胞培養(yǎng)體系滿足后續(xù)實驗的要求。
　　2.利用構(gòu)建的人原代子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)體系，采用MTT法觀察凋膜止崩方對離體子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖的生物學(xué)效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):凋膜止崩方作用于人子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞24h后，低劑量組(25ug/ml)未明顯抑制細(xì)胞增殖(P＞0.5)，中劑量組(50ug/ml)

7、明顯抑制子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖(P＜0.5)，大劑量組(1OOug/ml)顯著抑制子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖(P＜0.5)。作用48h后，大中劑量組（50、100ug/ml）顯著抑制子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖(P＜0.5)，其活性具有時效性和量效性。實驗結(jié)果顯示大劑量組抑制離體細(xì)胞增殖活性最強(qiáng)。
　　3.利用構(gòu)建的人原代子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)體系，采用RT-PCR及Western-blot方法觀察凋膜止崩方對子宮內(nèi)膜細(xì)胞中COX-2及K-ras表達(dá)的影響。

8、結(jié)果發(fā)現(xiàn):PCR檢測結(jié)果是COX-2在各組子宮內(nèi)膜細(xì)胞中均有表達(dá)（大劑量組除外），用藥組中的表達(dá)明顯低于對照組水平;K-ras在各組子宮內(nèi)膜細(xì)胞中均有表達(dá)，而用藥組中的表達(dá)水平明顯低于對照組，大劑量組呈明顯低表達(dá)，其生物學(xué)效應(yīng)呈劑量依賴性。Westen-blot檢測結(jié)果是K-ras大中小劑量組中呈低表達(dá);COX-2在大劑量組中不表達(dá)，在中小劑量組中低表達(dá)。且A組與B、C、D組(P＜0.5)，B、C組與D組有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.5)，其可