冷刺激誘導(dǎo)的內(nèi)臟脂肪棕色變對小鼠代謝的影響及機制研究.pdf

1、本文分為以下兩個部分進行探討：
　　論文Ⅰ 冷刺激對正常和肥胖小鼠內(nèi)臟脂肪的影響
　　目的：
　　1.研究冷刺激對正常小鼠VAT以及SAT、BAT的影響;
　　2.研究冷刺激對DIO小鼠VAT以及SAT、BAT的影響。
　　方法：
　　1.實驗動物:
　　所有動物實驗均遵守山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會的規(guī)定及要求。7-8周齡雄性C57BL/6野生型小鼠，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，引自美國

2、Jackson Laboratory。
　　2.動物實驗分組
　　第一部分 冷刺激模型的構(gòu)建（梯度降溫）:C57BL/6小鼠隨機分四組，30℃對照組和4℃、-10℃和-10℃/-20℃三個冷刺激組。冷刺激組置于18℃適應(yīng)一周后進入4℃中一周。此后4℃組保持在4℃至4周后實驗結(jié)束。-10℃和-10℃/-20℃組經(jīng)白天-5℃、夜晚4℃適應(yīng)三天后，再經(jīng)白天-10℃夜晚4℃適應(yīng)四天。此后-10℃組保持在-10℃中至3周后實驗結(jié)束。-

3、10℃/-20℃組則保持白天-20℃夜晚-10℃中至實驗結(jié)束。-10℃和-10℃/-20℃組的飲水頻繁更換，并在飼養(yǎng)籠中加入雪霜維持濕潤。30℃小鼠直接置于30℃中，時間與冷刺激組保持一致。
　　第二部分 C57BL/6給予含60％脂肪的高脂飲食4個月后隨機分為30℃，4℃，-10℃和-10℃/-20℃四個組，冷刺激方法同第一部分。
　　3.小鼠核心體溫和血壓的檢測:
　　上午10-12時測量小鼠直腸溫度為核心體溫;使

4、用小動物血壓計通過尾動脈袖套方法測量小鼠血壓。
　　4.小鼠脂肪的microPET掃描:
　　小鼠饑餓約3小時后異氟烷吸入麻醉，尾靜脈注射200～300μCi18F-FDG。一小時后，將小鼠不同部位的脂肪組織快速解剖下來行microPET掃描。
　　結(jié)果：
　　1.冷刺激對正常小鼠飲食量、體重(BW)、體重指數(shù)(BMI)、各部位脂肪重量、各臟器重量、核心體溫和血壓的影響
　　冷刺激增加小鼠飲食量，各冷刺激組

5、間無顯著差異。體重、體重指數(shù)、各部位脂肪重量減少。BW、BMI和eWAT、subcWAT重量隨溫度降低逐漸減少。各冷刺激組心臟增大;肝、脾和腎臟4℃時增大，溫度降低而減輕;肺臟無明顯變化。各組核心體溫和血壓無顯著差異。
　　2.冷刺激對正常小鼠VAT、SAT和BAT的影響
　　內(nèi)臟脂肪eWAT、腹膜后脂肪(rWAT)和腸系膜脂肪(mWAT)的HE和脂滴包膜蛋白PerilipinA染色顯示冷刺激下脂肪細(xì)胞逐漸變小，并出現(xiàn)多房樣

6、脂滴結(jié)構(gòu);棕色化指標(biāo)UCP1的免疫組化染色陽性證實發(fā)生了棕色變。冷刺激程度越大，UCP1的陽性染色越多，線粒體標(biāo)記物Prohibitin和血管內(nèi)皮Endomucin、CD31的染色也逐漸增多。冷刺激可以增加subcWAT和iBAT的UCP1、Prohibitin和Endomucin染色，subcWAT的棕色化程度隨溫度的降低升高，而各冷刺激組間iBAT分析無統(tǒng)計學(xué)差異。qPCR和WB檢測UCP1的表達顯示冷刺激可以上調(diào)各部位脂肪UCP1

7、的mRNA和蛋白水平。MicroPET掃描顯示隨著溫度的降低eWAT和subcWAT對18F-FDG的攝取增加，iBAT對18F-FDG的攝取在30℃時最低，冷刺激時明顯增加。
　　3.基因芯片及冷刺激對正常小鼠各部位脂肪產(chǎn)熱基因、脂肪因子和棕色化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子mRNA水平的影響
　　基因芯片結(jié)果顯示冷刺激可引起正常小鼠eWAT中一系列與代謝相關(guān)的通路改變，促進脂降解的相關(guān)基因表達上調(diào)。qPCR結(jié)果顯示冷刺激可上調(diào)正常小鼠eW

8、AT和subcWAT中與棕色化及脂降解相關(guān)的產(chǎn)熱基因Dio2、Cidea和Cox7a1的表達，下調(diào)脂肪因子Leptin、Adiponectin、Irisin的表達，對Resistin影響不大，棕色化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Pgc1α變化不明顯，Prdm16和Ebf2表達降低或不變。除輕度上調(diào)Dio2外冷刺激顯著下調(diào)iBAT中Cidea、Cox7a1、Leptin、Adiponectin、Irisin、Resistin、Pgc1α、Prdm16和Eb

9、f2表達，提示冷刺激對不同部位脂肪的作用不同。
　　結(jié)論：
　　1.冷刺激可減少正常及DIO小鼠各部位脂肪蓄積，并且此作用不依賴于進食量;
　　2.冷刺激可誘導(dǎo)正常小鼠VAT發(fā)生棕色變，同時激活BAT和皮下脂肪，VAT對冷刺激誘導(dǎo)棕色變的敏感性低于SAT;
　　3.冷刺激可誘導(dǎo)DIO小鼠VAT發(fā)生棕色變，同時激活BAT和皮下脂肪，與正常小鼠相比DIO小鼠SAT對冷刺激的敏感性較低;
　　4.冷刺激可改變VA

10、T的表達譜，促進脂降解相關(guān)基因表達，加速脂降解;
　　論文Ⅱ 內(nèi)臟脂肪棕色化對代謝的影響及機制研究
　　目的：
　　1.研究不同程度冷刺激對小鼠代謝的影響;
　　2.研究內(nèi)臟脂肪棕色變改善小鼠代謝的相關(guān)機制。
　　方法：
　　1.實驗動物:
　　7-8周齡雄性C57BL/6野生型小鼠購自北京北京華阜康生物科技股份有限公司，引自美國Jackson Laboratory。129S-Ucp1 tm1K

11、z/J小鼠，購自美國JacksonLaboratory。所有動物實驗均遵守山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會對動物實驗的規(guī)定及要求。
　　2.動物實驗分組
　　第一部分 正常小鼠冷刺激模型的構(gòu)建:同論文Ⅰ。
　　第二部分 飲食誘導(dǎo)的肥胖(DIO)小鼠冷刺激模型的構(gòu)建:同論文Ⅰ。
　　第三部分 附睪脂肪去除和移植實驗:手術(shù)去除eWAT后行冷刺激，冷刺激方法同論文Ⅰ。脂肪移植實驗30℃的小鼠隨機分為兩組，分別接受等量來自-1

12、0℃/-20℃或30℃小鼠的eWAT。
　　第四部分 UCP1-/-小鼠實驗:對UCP1-/-小鼠實施冷刺激。
　　第五部分 β3腎上腺素能受體激動實驗:室溫下C57BL/6小鼠隨機分兩組，一組接受β3腎上腺素能受體激動劑CL316243腹腔注射，另一組接受等量的生理鹽水作為對照。
　　3.小鼠血糖、糖耐量和胰島素耐量的檢測
　　使用羅氏血糖儀和試紙檢測血糖。糖耐量實驗小鼠過夜饑餓12h，胰島素耐量實驗小鼠饑餓6

13、h，冷刺激組置于18℃、30℃組置于30℃饑餓。給予小鼠腹腔注射2g/kg體重葡萄糖或0.5U/kg（正常小鼠）或0.75U/kg（肥胖小鼠）體重胰島素之前和15、30、60、90和120分鐘后采尾端血測定血糖。
　　4.小鼠代謝率的檢測:
　　麻醉好的小鼠放置于33℃的小動物呼吸代謝檢測儀中測量30分鐘基礎(chǔ)狀態(tài)下的氧耗量和二氧化碳呼出量，皮下注射1mg/kg體重去加腎上腺素后繼續(xù)檢測90分鐘代表非戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱(NST)能力。

14、
　　結(jié)果：
　　1.冷刺激對正常小鼠代謝的影響
　　NST檢測冷刺激可顯著增加小鼠的氧耗量和二氧化碳呼出量，-10℃和-10℃/-20℃的氧耗量和二氧化碳呼出量高于4℃，冷刺激顯著增強小鼠代謝，提高適應(yīng)性產(chǎn)熱能力。冷刺激可以顯著降低血TG、NEFA和LDL-C的水平，TG的降低呈現(xiàn)溫度依賴性，溫度越低下降越明顯。冷刺激有降低TC、HDL-C的趨勢，-10℃/-20℃組TC、HDL-C水平低于其他各組?？崭寡歉鹘M間無

15、統(tǒng)計學(xué)差異，-10℃/-20℃組的空腹胰島素水平顯著降低，GTT和ITT實驗顯示-10℃和-10℃/-20℃組血糖水平和曲線下面積低于30℃和4℃，說明內(nèi)臟脂肪棕色化可以改善小鼠糖耐量和胰島素耐量。
　　2.冷刺激對DIO小鼠代謝的影響
　　與30℃相比，冷刺激可增加DIO小鼠的代謝，-10℃和-10℃/-20℃組的NST能力高于4℃。冷刺激顯著降低血TG、TC和LDL-C的水平，-10℃和-10℃/-20℃組TG水平低于4

16、℃組。冷刺激可以明顯降低DIO小鼠的空腹血糖和空腹胰島素水平，-10℃和-10℃/-20℃組血糖和胰島素水平低于4℃組。GTT和ITT實驗顯示各-10℃和-10℃/-20℃組血糖水平和曲線下面積低于30℃和4℃，證實冷刺激改善肥胖小鼠糖耐量和胰島素耐量。冷刺激可以減輕DIO小鼠肝臟重量，減少肝內(nèi)的脂質(zhì)沉積。
　　3.內(nèi)臟脂肪棕色化可激活Creatine驅(qū)動的替代產(chǎn)熱途徑，但UCP1主導(dǎo)的產(chǎn)熱起主要作用
　　冷刺激可以增加eW

17、AT中肌酸激酶(CK)的活性，棕色化程度越高，CK活性越高。冷刺激可增加eWAT中Creatine的含量，同時降低PCr的含量，-10℃/-20℃組Creatine含量最高，PCr含量最低，表明CK/Cr/PCr途徑被激活。冷刺激可降低UCP1-/-小鼠核心體溫，致使在零下低溫環(huán)境中無法存活，表明替代產(chǎn)熱途徑無法取代UCP1介導(dǎo)的產(chǎn)熱。
　　結(jié)論：
　　1.冷刺激可促進正常和DIO小鼠的代謝和NST能力，激活的內(nèi)臟脂肪可影響