新型補(bǔ)體抑制劑CP40抗靈長類同種腎移植急性體液性排斥反應(yīng)的實(shí)驗研究.pdf

1、第一部分、CP40抗靈長類動物同種腎移植急性抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)的實(shí)驗研究
　　目的：探討compstatin類似物CP40抑制體內(nèi)補(bǔ)體激活的效果及CP40聯(lián)合CsA三聯(lián)免疫抑制療法能否克服早期的AAMR
　　方法：三例健康獼猴分別皮下注射2mg/kg的CP40，注射前（0h）和注射3h后分別抽血，留取血漿，采用異種抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒模型檢測 CP40抑制補(bǔ)體激活的能力，并計算補(bǔ)體抑制率；皮膚致敏2周后，將供者腎臟移植

2、到皮膚致敏同一受體，切除受體自體雙腎，術(shù)后應(yīng)用 CP40聯(lián)合環(huán)孢素+嗎替麥考酚酯+強(qiáng)的松三聯(lián)免疫抑制劑療法（CsA+MMF+Pred）觀察存活，定期行移植物活檢或按計劃切除移植物，并對移植物進(jìn)行常規(guī)HE、石蠟切片免疫組化和冰凍切片免疫熒光染色。
　　結(jié)果：單次皮下注射CP40后，三例獼猴0h靶細(xì)胞死亡率分別為78.2％、91.6%和92%，3h的靶細(xì)胞死亡率分別為25.3%、45.4%和40%，補(bǔ)體活性抑制率分別為75.4%、46

3、.8%和54.5%,平均為58.9%±14.8；采用CP40聯(lián)合CsA三聯(lián)免疫抑制劑療法的三例受體中，兩例分別在術(shù)后4天和5天因肌酐>700umol/L主動處死，一例長期存活，>400天。術(shù)后1周內(nèi)死亡的移植物HE、石蠟切片免疫組化和冰凍切片免疫熒光染色檢測發(fā)現(xiàn)為典型的急性抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)（AAMR）表現(xiàn)，并伴有輕度的細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)，長期存活的移植物活檢腎臟結(jié)構(gòu)基本正常,未發(fā)現(xiàn)體液性排斥的證據(jù)。
　　結(jié)論：CP40顯示了良好

4、的體內(nèi)補(bǔ)體抑制效果，但其不能完全抑制補(bǔ)體激活，其聯(lián)合CsA三聯(lián)免疫抑制劑療法并不能完全克服術(shù)后早期的AMMR，僅能使部分移植物獲得長期存活。
　　第二部分、CP40抑制補(bǔ)體激活的能力在食蟹猴、獼猴和人之間的對比研究
　　背景：compstatin及其類似物能夠特異地與非人靈長類和人循環(huán)中的C3結(jié)合，有效阻止C3裂解為C3a和C3b，從而阻止靶細(xì)胞免于損傷或裂解，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。CP40是compstatin類似物，與

5、補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)中關(guān)鍵分子C3結(jié)合的能力較Compstatin更強(qiáng)，但其尚未在非人靈長類疾病或移植模型中應(yīng)用。CP40對食蟹猴、獼猴和人血漿中C3激活的抑制能力是否相同，有無劑量依賴效應(yīng)目前尚未有報道。
　　方法：收集食蟹猴、獼猴和人的外周血，離心后收集血漿，分別與不同終濃度的CP40藥物預(yù)孵育。預(yù)孵育過的血漿再與永生化豬內(nèi)皮細(xì)胞（PEDs）孵育。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測PEDs的死亡率和異種天然抗體IgG、IgM以及補(bǔ)體裂解片段C3c、C

6、4c、C5b-9在PEDs表面的沉積水平；采用細(xì)胞熒光檢測天然異種抗體IgG、IgM和補(bǔ)體裂解片段C3c、C4c、C5b-9的沉積水平。
　　結(jié)果：除低濃度CP40（0.01mg/ml）組外，高濃度CP40（≥0.05mg/ml）組三種屬血漿，其相應(yīng)的PEDs的殺傷率均較陽性對照血漿（正常未處理血漿）明顯降低（均P<0.001），且當(dāng)CP40≥0.05mg/ml時，同屬各組間PED s的殺傷率均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；同一濃

7、度CP40預(yù)孵育的血漿，食蟹猴和人相應(yīng)的PED s殺傷率明顯低于獼猴（P<0.001）。與0.05mg/ml的CP40預(yù)孵育后的三種屬血漿，其靶細(xì)胞表面C3c和C5b-9的沉積（Gmea n值）較陽性對照明顯降低，但仍比陰性對照稍高，細(xì)胞熒光顯示弱陽性。無論是否與CP40孵育，流式細(xì)胞術(shù)檢測C4c和異種抗體IgG、IgM在靶細(xì)胞表面沉積沒有明顯的差異。
　　結(jié)論：CP40在本體外實(shí)驗中展示了較強(qiáng)的抑制補(bǔ)體激活的能力，但在異種抗體介

8、導(dǎo)的補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒模型中不能完全抑制補(bǔ)體激活；當(dāng)CP40終濃度≥0.05mg時，沒有劑量依賴效應(yīng)，進(jìn)一步增加劑量不能提高補(bǔ)體抑制能力；食蟹猴可能對CP40較獼猴更為敏感，為CP40在非人靈長類動物模型中的應(yīng)用選擇合適的動物提參考依據(jù)。此外，用PEDs作為靶細(xì)胞通過流式檢測compstatin及其類似物抑制補(bǔ)體C3的活性可作為一種新的、簡單、可重復(fù)和敏感的檢測方法。
　　第三部分、猴皮質(zhì)區(qū)腎小管上皮細(xì)胞在檢測AB O血型抗體水平中的

9、應(yīng)用
　　目的：探討猴皮質(zhì)區(qū)腎小管上皮細(xì)胞能否用來檢測血清中ABO血型抗體水平
　　方法：切取一只A型健康食蟹猴一側(cè)腎臟，通過Collagenase/Dispase復(fù)合酶消化后培養(yǎng)原代腎臟皮質(zhì)區(qū)腎小管上皮細(xì)胞（RCTECs），并通過western blot法和流式細(xì)胞術(shù)對分離培養(yǎng)的原代RCTECs進(jìn)行表型鑒定。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對RTECs表達(dá)組織-血型抗原（A抗原）的比例進(jìn)行檢測，并通過檢測血清中針對A抗原的血型抗體水平與人紅

10、細(xì)胞法進(jìn)行比較，再次利用原代RCTECs檢測ABO血型不合腎移植術(shù)前和術(shù)后不同時間點(diǎn)的血型抗體水平。
　　結(jié)果：分離得到的腎臟皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞經(jīng)鑒定幾乎為原代RCTECs（91%），極少量血管內(nèi)皮細(xì)胞（2.09%）；約73.5%的原代RCTECs表達(dá)組織血型抗原A，而且短期凍存3月和6月對原代RCTECs表達(dá)組織血型抗原的比例沒有影響，凍存復(fù)蘇后組織血型抗原 A的表達(dá)水平分別為73.7%和70.8%。針對鑰孔戚血藍(lán)蛋白偶聯(lián)的血型抗原A（

11、KLH-A）致敏B型受體猴前和致敏后的同一份血清，原代RCTECs檢測的結(jié)果顯示致敏前后血清出現(xiàn)最高幾何平均熒光強(qiáng)度（Gmean值）時的滴度均為1:16，致敏前血清的Gmean值降至基線水平時的滴度為1:128，而致敏后為1:8192，無細(xì)胞凝集現(xiàn)象，同一滴度時，致敏前血清 Gmean值均低于致敏后血清，而紅細(xì)胞致敏前后血清出現(xiàn)最高Gmean值時的滴度分別為1:128和1:32，致敏后血清滴度在1:64-1:512間紅細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的凝