HSP70阻抑應(yīng)激心肌細(xì)胞凋亡Fas通路的FAF1調(diào)控機(jī)制.pdf

1、應(yīng)激是機(jī)體在應(yīng)對(duì)生存環(huán)境多種不利因素過(guò)程中，認(rèn)知或?qū)嶋H上的需求與應(yīng)對(duì)能力之間不平衡所導(dǎo)致的機(jī)體的心理生理緊張狀態(tài)及其反應(yīng)。長(zhǎng)期的高應(yīng)激負(fù)荷可導(dǎo)致心功能紊亂、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等多種嚴(yán)重心血管疾病的發(fā)生。心肌細(xì)胞凋亡是心肌損傷發(fā)生的重要細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)之一，F(xiàn)as信號(hào)通路是心肌細(xì)胞凋亡的重要途徑。前期研究發(fā)現(xiàn)HSP70可阻抑Fas通路的活化以減緩應(yīng)激所致心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，但對(duì)其分子機(jī)制尚不清楚。FAF1(Fas-associated fac

2、tor-1)作為死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物(death inducing signaling complex，DISC)的重要組成部分，對(duì)于Fas通路活化具有重要的調(diào)控作用，被稱為Fas通路的重要調(diào)控元件。對(duì)FAF1分子結(jié)構(gòu)的分析表明，HSP70、Fas與FAF1的結(jié)合位點(diǎn)存在著明顯的重疊區(qū)，在FAF1分子的82-180氨基酸區(qū)域，HSP70、Fas與FAF1結(jié)合域甚至完全相同，提示了HSP70、Fas在與FAF1的結(jié)合中存在著相互競(jìng)爭(zhēng)性抑制的

3、可能性。因此，認(rèn)識(shí)應(yīng)激心肌細(xì)胞中FAF1表達(dá)水平的變化規(guī)律及其對(duì)應(yīng)激心肌細(xì)胞凋亡Fas通路的影響，揭示FAF1在HSP70阻抑應(yīng)激心肌細(xì)胞凋亡Fas通路中的節(jié)點(diǎn)調(diào)控作用，認(rèn)識(shí)FAF1與HSP70相互作用對(duì)Fas-FAF1相互作用及DISC形成的影響，發(fā)現(xiàn)FAF1在HSP70阻抑應(yīng)激心肌細(xì)胞凋亡Fas通路中生物學(xué)作用的分子基礎(chǔ)，有助于闡明應(yīng)激致心肌細(xì)胞凋亡的生物學(xué)基礎(chǔ)，對(duì)于HSP70阻抑應(yīng)激致心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究，有助于探索和發(fā)現(xiàn)防治應(yīng)

4、激致心血管損傷的新的醫(yī)學(xué)途徑。
　　一、應(yīng)激致心肌細(xì)胞凋亡模型中FAF1的表達(dá)規(guī)律
　　結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期研究，選取180-200g Wistar大鼠以間歇式束縛應(yīng)激模式誘導(dǎo)應(yīng)激動(dòng)物模型建立，應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室研制的大鼠束縛艙對(duì)大鼠進(jìn)行每天6h的束縛應(yīng)激，三個(gè)應(yīng)激組大鼠束縛應(yīng)激持續(xù)時(shí)間為1w、2w和3w，對(duì)照組大鼠不進(jìn)行束縛應(yīng)激。建模完成后，應(yīng)激2w和3w組大鼠血漿中糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)和去甲腎上腺素(N

5、orepinephrine，NE)水平較對(duì)照組顯著升高;心肌組織TUNEL染色顯示，應(yīng)激組大鼠心肌組織中細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組顯著升高，表明束縛應(yīng)激致大鼠心肌損傷模型成功建立。采用western blot檢測(cè)應(yīng)激致心肌細(xì)胞凋亡的動(dòng)物模型中心肌組織FAF1的表達(dá)水平，可見(jiàn)FAF1水平隨束縛應(yīng)激時(shí)間的增長(zhǎng)而逐漸升高，并與應(yīng)激心肌細(xì)胞的凋亡率具有明確的相關(guān)性規(guī)律。
　　依據(jù)束縛應(yīng)激大鼠血漿NE水平，分別對(duì)四組H9c2細(xì)胞給予0μM，5μM，

6、20μM，50μM NE干預(yù)36h，構(gòu)建應(yīng)激致心肌細(xì)胞凋亡的細(xì)胞模型，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同劑量NE干預(yù)下H9c2細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果顯示，NE可誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞的凋亡，且存在劑量效應(yīng)關(guān)系，應(yīng)激致心肌細(xì)胞凋亡模型構(gòu)建成功。采用western blot檢測(cè)應(yīng)激細(xì)胞中FAF1的表達(dá)水平，F(xiàn)AF1表達(dá)水平隨NE濃度的增加而逐漸升高，與應(yīng)激細(xì)胞的凋亡率也存在相關(guān)性。
　　二、FAF1在應(yīng)激心肌細(xì)胞凋亡中的生物學(xué)功能
　　在應(yīng)激心肌細(xì)胞

7、凋亡模型中，采用western blot檢測(cè)FAS蛋白表達(dá)水平，采用caspase-8活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)NE作用下H9c2細(xì)胞中caspase-8的活性水平，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示，NE可顯著升高細(xì)胞中的FAS表達(dá)水平，且caspase-8活性亦顯著升高，提示應(yīng)激心肌細(xì)胞中Fas通路的活化。構(gòu)建并轉(zhuǎn)染FAF1高表達(dá)載體，調(diào)控心肌細(xì)胞中FAF1表達(dá)水平升高;設(shè)計(jì)并合成了FAF1的siRNA，特異性敲低細(xì)胞FAF1表達(dá)水平，

8、觀察不同F(xiàn)AF1表達(dá)水平對(duì)細(xì)胞FAS通路活化狀態(tài)和細(xì)胞凋亡水平影響。研究結(jié)果顯示，在50μM NE誘導(dǎo)的應(yīng)激心肌細(xì)胞中，F(xiàn)AF1的高表達(dá)可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中caspase-8活性和細(xì)胞凋亡率顯著升高;而siRNA抑制FAF1表達(dá)后，caspase-8活性和細(xì)胞凋亡率明顯下降。心肌細(xì)胞FAF1水平與細(xì)胞caspase-8活性和細(xì)胞凋亡率存在正相關(guān)關(guān)系，表明了FAF1在心肌細(xì)胞中發(fā)揮促凋亡的作用。
　　三、HSP70在應(yīng)激致心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)

9、程中的調(diào)控作用
　　構(gòu)建HSP70高表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)HSP70高表達(dá);應(yīng)用熱休克蛋白抑制劑KNK437阻抑H9c2細(xì)胞內(nèi)HSP70表達(dá);分別給予上述HSP70高表達(dá)或表達(dá)抑制的H9c2細(xì)胞以50μM NE干預(yù)36h，建立不同HSP70水平的應(yīng)激心肌細(xì)胞模型。應(yīng)用western blot檢測(cè)細(xì)胞中FAS水平，應(yīng)用caspase-8活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)caspase-8活性，研究HSP70表達(dá)水平對(duì)應(yīng)激心肌細(xì)胞凋亡

10、的影響。結(jié)果表明，高表達(dá)HSP70能降低細(xì)胞中FAS表達(dá)水平，并繼而降低caspase-8活性;抑制HSP70表達(dá)水平，則引起FAS表達(dá)水平和caspase-8活性水平的升高。提示HSP70對(duì)應(yīng)激所致心肌細(xì)胞凋亡Fas通路的激活具有明顯的抑制作用，從而降低應(yīng)激所導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生重要的保護(hù)作用。
　　四、FAF1在HSP70阻抑心肌細(xì)胞凋亡Fas通路中的生物學(xué)作用及其機(jī)制
　　采用免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)H9c2細(xì)

11、胞中HSP70、FAF1及FAS的相互作用。結(jié)果表明，HSP70與FAF1之間、FAS與FAF1之間均存在相互作用。構(gòu)建HSP70全長(zhǎng)序列高表達(dá)載體pEGFP-rHSP70和HSP70 N末端1-120位氨基酸缺失的突變體pEGFP-N1/rHsp70△N-(121-642)，轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞后，采用免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)HSP70與FAF1之間的相互作用，結(jié)果顯示，N末端1-120位氨基酸缺失的HSP70突變體不再與FAF1產(chǎn)生相互作用

12、，表明HSP70與FAF1的作用區(qū)域是位于HSP70 N末端的1-120位氨基酸區(qū)域。
　　在H9c2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染HSP70全長(zhǎng)序列高表達(dá)載體，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)HSP70高表達(dá)，采用免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)FAS與FAF1的相互作用。研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，高表達(dá)HSP70的細(xì)胞中，與FAS相互作用的FAF1水平降低，細(xì)胞中Fas通路活化水平下降。HSP70的表達(dá)水平對(duì)FAS-FAF1相互作用及DISC形成具有重要影響，對(duì)應(yīng)激心肌細(xì)胞的凋亡

13、具有重要的調(diào)節(jié)作用。
　　在50μM NE干預(yù)的H9c2細(xì)胞中，分別轉(zhuǎn)染HSP70全長(zhǎng)序列高表達(dá)載體和HSP70 N末端1-120位氨基酸缺失的突變體，采用caspase-8活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)H9c2細(xì)胞中caspase-8的活性水平，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染全長(zhǎng)序列HSP70高表達(dá)載體可顯著緩解NE引起的細(xì)胞caspase-8活性的升高和細(xì)胞凋亡率的升高，而轉(zhuǎn)染HSP70 N末端1-120位氨基酸缺失突變體的

14、細(xì)胞中，NE引起的caspase-8活性的升高和細(xì)胞凋亡率的升高未見(jiàn)明顯降低。這表明FAF1與HSP70之間的相互作用可影響Fas通路的活化程度，與HSP70對(duì)應(yīng)激心肌細(xì)胞的保護(hù)作用密切相關(guān)。
　　綜上所述，本研究在動(dòng)物和細(xì)胞水平上系統(tǒng)研究了應(yīng)激心肌細(xì)胞FAF1在HSP70對(duì)應(yīng)激心肌細(xì)胞保護(hù)機(jī)制中的生物學(xué)作用及其分子機(jī)制。研究結(jié)果表明，應(yīng)激狀態(tài)下，心肌細(xì)胞中FAF1高表達(dá)，并進(jìn)一步促進(jìn)心肌細(xì)胞Fas通路的活化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。HSP

15、70通過(guò)與FAS競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合FAF1，弱化了FAF1和FAS的相互作用，阻抑了DISC的形成，抑制了caspase-8活化所介導(dǎo)Fas通路的活化，對(duì)應(yīng)激心肌細(xì)胞凋亡通路具有重要的節(jié)點(diǎn)調(diào)控作用。FAF1是HSP70阻抑應(yīng)激心肌細(xì)胞凋亡Fas通路的重要作用靶點(diǎn)。本研究結(jié)果揭示了HSP70對(duì)應(yīng)激心肌細(xì)胞保護(hù)作用的重要分子機(jī)制，這對(duì)于闡明心肌細(xì)胞應(yīng)激的生物學(xué)基礎(chǔ)、探索HSP70抑制應(yīng)激心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制、開(kāi)拓防治應(yīng)激致心血管損傷的新的醫(yī)學(xué)途徑具有