肝癌代謝組學及藍萼甲素干預機制研究.pdf

1、肝細胞肝癌是一種最常見的腹內(nèi)惡性腫瘤，其死亡率在惡性腫瘤中位列第二位，是嚴重威脅我國人民生命健康的疾病。然而目前的肝癌診斷技術與治療方法并不能滿足人們的需求，因此我們迫切地需要尋找新的早期診斷標志物，并發(fā)現(xiàn)新的能夠更有效治療肝癌的藥物。本論文結合液質(zhì)聯(lián)用、氣質(zhì)聯(lián)用和核磁共振等多種分析技術，聯(lián)合代謝組學的研究模式對肝癌與藍萼甲素進行了研究，旨在系統(tǒng)地探尋肝癌的本質(zhì)和藍萼甲素的作用機理:
　　樣品前處理是代謝組學研究的第一步，選擇較好

2、的前處理方法為得到可靠的結果奠定了基礎。在液質(zhì)樣品前處理優(yōu)化方面，通過綜合所有提取溶劑所得的代謝物特征峰的總數(shù)、整體代謝物RSD的分布與主成分分析的結果，本研究發(fā)現(xiàn)了幾種優(yōu)化的血漿制備方法。即在反相色譜柱分析中，甲醇/乙醇與甲醇/乙醇/乙腈這兩種混合溶劑是相對來說比較優(yōu)化的方法;而在親水作用色譜柱分析中，甲醇/乙腈與乙醇/乙腈這兩種提取混合提取溶劑是綜合來說比較好的選擇。在氣質(zhì)樣品前處理優(yōu)化方面，傳統(tǒng)的氣質(zhì)樣品前處理方法步驟繁瑣、耗時漫

3、長，應用微波輔助的方法完成肟化與硅烷基化進行血漿樣品的制備為我們提供了一種耗時較短和效率更高的選擇。接下來，通過響應面優(yōu)化設計的方案有效地優(yōu)化了微波輔助肟化和硅烷基化的條件，并在不影響提取物數(shù)目與含量的前提下，將原來180分鐘的制備時間縮短到5分鐘。這種創(chuàng)新的微波輔助技術十分有效并省時，該方式提供了一種高通量制備代謝組學血漿樣本的方法。
　　基于之前優(yōu)化的樣品前處理方法，通過核磁共振和液質(zhì)聯(lián)用等分析方法并結合隨機森林算法，對肝細胞

4、肝癌患者、肝硬化患者和健康志愿者的血清樣本進行了代謝輪廓分析。根據(jù)三種分析方法的數(shù)據(jù)鑒定了三十二個潛在生物標志物，并且使用這些生物標志物建立的模型對肝細胞肝癌診斷的可行性進行了評估。結果表明，即使是在很多肝細胞肝癌患者的AFP值低于20ng/mL的情況下，區(qū)分肝細胞肝癌患者和肝硬化患者的過程中該模型實現(xiàn)了幾乎100％的敏感性和特異性。肝細胞肝癌引起的代謝通路改變包括了:酮體合成代謝，檸檬酸循環(huán)，磷脂代謝，鞘脂類代謝，脂肪酸氧化，氨基酸分

5、解代謝和膽汁酸代謝通路。本章的結果表明，這些鑒定的潛在生物標志物可能為肝細胞肝癌患者的早期診斷和預后評估帶來了新的契機。此外，本研究還證明了，隨機森林分類算法適合用于篩選代謝組學的潛在生物標志物。
　　之后，本課題組利用GC-MS、RPLC-MS和HILIC-MS三種分析方法來探索GLA給藥組與正常對照組之間的代謝物變化，并進一步將所得到的數(shù)據(jù)輸入到多變量分析方法中研究。在細胞增殖實驗證明了GLA對SMMC7721肝癌細胞有抑制作

6、用之后，利用細胞周期與細胞凋亡實驗進一步驗證了GLA對肝癌細胞的影響。接著，通過PCA與OPLS-DA分析手段選擇并驗證了24個生物標志物。本研究從整體代謝水平來評價GLA給藥對SMMC7721肝癌細胞系的影響，并且對它抑制肝癌細胞的機制做出一定的闡述。這將有助于進一步了解這個疾病的發(fā)展，也將有助于使用與評估藥物的療效以及藥物的作用方式。研究中篩選發(fā)現(xiàn)的潛在生物標志物涉及到了很多代謝通路，這表明GLA可以通過影響脂類代謝、鞘脂代謝、嘌呤