應激及其藥物干預的代謝組學研究.pdf

1、應激是指當機體遭遇包括創(chuàng)傷、中毒、環(huán)境溫度劇烈變化、饑餓疲勞以及情緒緊張、恐懼、激動等各種強烈的刺激時，促腎上腺皮質激素、糖皮質激素的分泌即刻大幅度增加，引起機體的各種適應性、抵抗性變化的一種機能狀態(tài)。急性應激反應是自我限制的過程，一旦應激原的作用終止后，體內的自穩(wěn)態(tài)得到恢復，應激反應的過程也就停止。但是如果應激原的作用過度強烈，導致促皮質素釋放激素和去甲腎上腺素大量分泌，就會影響生物體的多種生理機能。長期強烈身心應激嚴重影響著的身心健

2、康，使機體出現抑郁癥、學習和記憶障礙、應激性精神紊亂、癡呆、正常衰老過程加速、免疫力低下等等多系統(tǒng)疾患。目前研究應激的絕大部分研究工作是圍繞生物體的組織和血液進行的，而這些生物樣本的采集本身對于機體也構成了另一種應激，進而可能對結果產生干擾和誤導；因為機體的應激反應是一個動態(tài)的過程，這樣的研究缺乏對于動物整體狀態(tài)變化的連續(xù)監(jiān)測；應激也是一個系統(tǒng)反應，涉及到生物體的各個生理過程，影響眾多代謝通路，僅依靠幾個指標遠不能反映其全貌。對于長期應

3、激所產生的亞健康狀態(tài)，以及藥物的抗應激作用，在醫(yī)學上始終沒有找到合適的客觀評價標準?；谏鲜鰡栴}，我們希望采用一種無刺激、連續(xù)動態(tài)的系統(tǒng)的研究方法來評價機體的應激狀態(tài)，探索其機制，從而建立客觀的評價標準，為臨床和實驗室中應激及相關疾病的判定提供依據。代謝組學又稱代謝物組學，是研究機體代謝產物譜變化的一種新的系統(tǒng)方法。作為一種“組學”科學，它借助高通量、高靈敏度與高精確度的現代分析技術，分析細胞、組織和其它生物樣本如血液或尿液中內源性代謝

4、物整體組成并通過其復雜的、動態(tài)的變化來辯識和解析被研究對象的生理病理狀態(tài)。代謝物組是蛋白質組、轉錄組和基因組總體表達的結果，直接反映組織的生化狀態(tài)，能夠較靈敏地刻畫生命體生理病理狀態(tài)的變化，對于闡明生命復雜系統(tǒng)具有極為重要的意義。其最主要的特征就是高通量的實驗和大規(guī)模的計算，從系統(tǒng)生物學的角度出發(fā)，全面地綜合地考察機體代謝的變化。本文建立了代謝組學方法評價和研究急慢性應激和相關疾病以及不同藥物干預的效果，主要內容如下： 1.建立

5、急性冷應激的代謝組學評價方法，采用氯甲酸乙酯衍生化GC/MS的分析方法測定冷應激前后大鼠的尿樣，得到尿中小分子代謝物的指紋圖譜，結合模式識別(PCA和PLS-DA)等多維統(tǒng)計分析方法計算，峰響應信號的主成分分析圖上顯示冷應激前后正常大鼠尿液內源性代謝物產生明顯分離，人參組則幾乎無分離。采用多維與單維統(tǒng)計結合的方法，找到與正常大鼠冷應激前后分組相關的物質，發(fā)現其中與應激相關的部分代謝物如酪氨酸、色氨酸等物質的相對含量產生顯著變化，從這些變

6、化可推測機體系統(tǒng)對冷應激的應答以及應激后自我調節(jié)的過程，而這些物質中絕大多數在人參皂苷組中變化的顯著性降低或者已無顯著性。從代謝物的角度證實冷應激對機體作用、機體的自我恢復以及人參皂苷的抗應激作用。 2.建立快速、高效的固相萃取-超高效液相色譜質譜聯(lián)用的方法同時定量測定大鼠尿液中的17種人參皂苷含量。選擇萃取回收率和重復性高的HLB固相萃取柱，同時優(yōu)化液相色譜及質譜的儀器條件，方法的專屬性、線性范圍、回收率、日內日間精密度和穩(wěn)定

7、性均符合生物樣本的測定要求。采用該方法測定了正常狀態(tài)下和冷應激過后大鼠尿樣中皂苷類代謝物，結合多、單維數據分析后發(fā)現冷應激可顯著改變Rc、Rb1等人參皂苷類物質在尿液中的含量。 3.采用慢性應激和孤養(yǎng)兩種經典模型相結合的制模方法制作慢性輕度不可預見性的應激抑郁模型，在27天的應激過程中測定了敞箱實驗行為學得分，24h攝食總量，體重，游泳不動時間，糖水消耗量，腎上腺、胸腺和脾重量以及腎上腺、胸腺以及脾指數，血漿促皮質激素(ACTH

8、)和血清皮質酮水平。以上指標反應了隨著應激時間的延長，模型組大鼠逐漸呈現出類似于人類抑郁癥的癥狀。同時進行的藥物干預中，人參皂苷組各項指標均顯著優(yōu)于模型組，氯米帕明和貫葉連翹提取物組總體優(yōu)于模型組，對動物的抑郁狀態(tài)表現出不同程度的干預作用。 4.建立慢性應激的代謝組學評價方法，采用氣相-質譜聯(lián)用結合多維統(tǒng)計數學處理方法考察了慢性應激過程中大鼠尿液樣本。內源性代謝物峰響應信號的主成分分析圖上顯示慢性應激組9，27天大鼠尿樣可與0天

9、該組以同天對照組顯著分離。采用多維與單維統(tǒng)計結合的方法，分別找到與分組相關的物質的交集。在差異表達的代謝物的交集中，第9天的結果與急性應激的差異物質部分一致，顯示了應激反應的特異性。第27天的結果與應激和抑郁癥均有關系，這些物質中絕大多數在給藥+應激組中變化的顯著性降低或者無顯著性，因此可從代謝物的角度證實了這三種抗抑郁藥物的作用。 5.采用氣相-質譜聯(lián)用結合多維統(tǒng)計數學處理方法考察了慢性應激后各組大鼠的腦組織提取液。內源性代謝

10、物峰響應信號的主成分分析圖上顯示慢性應激組與對照組顯著分離，給藥組呈現不同程度的回歸趨勢。采用多維與單維統(tǒng)計結合的方法，分別找到與慢性應激和正常大鼠分組相關的小分子內源性代謝物，發(fā)現腦組織中與應激以及抑郁相關代謝物的含量發(fā)生顯著變化，這些物質中多數在給藥組中變化的顯著性降低或者無顯著性。三種抗抑郁劑中，人參皂苷改善的代謝物最多也最為明顯，貫葉連翹提取物次之，氯米帕明最少。從代謝組學的角度研究了慢性應激導致的腦組織代謝物譜的變化，同時證實