piRNA-823：一種型非編碼小RNA在結(jié)直腸癌中的促腫瘤生成作用.pdf

1、DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的催化下，將S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)的甲基轉(zhuǎn)移到特定堿基上的過程。DNMT分為兩類:一類是持續(xù)性甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1，主要參與DNA復制過程中新合成鏈的甲基化;另一類是從頭甲基轉(zhuǎn)移酶，包括DNMT3A和DNMT3B，主要介導CpG位點甲基化，通過表觀遺傳學機制調(diào)控細胞生長分化。DNA甲基化參與了基因組印記

2、、X染色體失活以及重復元件抑制過程，為正常發(fā)育所必需。近年來研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化異?？蓪е略┗蚣せ钜约耙职┗蚴Щ睿瑥亩鴮е掳┌Y的發(fā)生。
　　結(jié)直腸癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生涉及基因突變及表觀遺傳學改變。其中表觀遺傳學改變更為常見，且影響著數(shù)百個腫瘤相關基因。DNA甲基化異常是最主要的表觀遺傳學改變，包括總體基因的低甲基化和特定區(qū)域的高甲基化，前者可導致原癌基因激活，后者主要發(fā)生在啟動子區(qū)域的CpG島，可導致抑癌基

3、因失活，這兩種甲基化異常在散發(fā)性結(jié)腸癌發(fā)生中起著重要作用。
　　Piwi蛋白相互作用RNAs（Piwi-interacting RNAs，piRNAs）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類非編碼小RNAs。其僅僅與Argonaute蛋白家族的piwi亞家族蛋白結(jié)合，而不與Ago亞家族蛋白結(jié)合，因此被命名為piRNAs。最初，piRNAs被認為僅存在于生殖干細胞中，通過DNA甲基化沉默轉(zhuǎn)座子來維持基因組的完整性，從而在生殖干細胞中發(fā)揮著表觀遺傳調(diào)控

4、作用。最近，在多種癌細胞中發(fā)現(xiàn)了piRNAs的異常表達，如胃癌、宮頸癌、乳腺癌和膀胱癌等等，且大量證據(jù)均表明，癌細胞與干細胞具有相似的表觀遺傳信號，這暗示，piRNAs可能在癌癥的發(fā)生中也發(fā)揮著相似的表觀遺傳調(diào)控作用。
　　piRNA-823為piRNAs成員之一，在不同類型的腫瘤中其表達及作用不同。在胃癌中piRNA-823表達降低，但在多發(fā)性骨髓瘤中其表達升高，并增加了從頭甲基化水平，然而，piRNA-823在結(jié)直腸癌中的功能

5、尚不明確。
　　本課題旨在研究piRNA-823在結(jié)直腸癌中的表達及其對結(jié)腸癌細胞系HCT116增殖、凋亡及克隆形成能力的影響，并進一步探討其在結(jié)直腸癌表觀遺傳調(diào)控中的功能，為開發(fā)以piRNAs為靶點的結(jié)直腸癌治療提供理論依據(jù)。
　　目的:研究piRNA-823在結(jié)直腸癌中的表達及其對結(jié)腸癌細胞系HCT116生物學行為的影響，并進一步探討其對DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達的影響。
　　方法:從河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院收集14對手術切

6、除的新鮮結(jié)直腸癌及其癌旁組織標本用于實驗。應用real time RT-PCR檢測piRNA-823在結(jié)直腸癌及其癌旁組織中的表達差異，并進一步應用結(jié)腸癌細胞系HCT116研究piRNA-823在結(jié)直腸癌中的功能。在HCT116細胞中轉(zhuǎn)染piRNA-823的抑制劑piRNA-823 antagomir，通過real time RT-PCR觀察轉(zhuǎn)染效率。應用CCK-8實驗檢測細胞增殖情況，應用流式細胞術觀察細胞周期變化，AnnexinⅤ/

7、PI雙染及TUNEL技術檢測細胞凋亡情況，并進一步應用western blot檢測凋亡相關蛋白（caspase-8、caspase-9和caspase-3）的活性。最后，為了解piRNA-823與DNA甲基化的關系，應用western blot觀察其對DNMT1、DNMT3A、DNMT3B表達的影響。
　　結(jié)果:①Real time RT-PCR結(jié)果顯示，piRNA-823在結(jié)直腸癌組織中的表達明顯高于其配對的癌旁組織（P＜0.0

8、5），并且以癌旁組織為對照，結(jié)腸癌細胞系HCT116中piRNA-823的表達也升高（P＜0.001）。②CCK-8實驗結(jié)果顯示，三種不同濃度的piRNA-823的抑制劑piRNA-823antagomir（10 nmol/L、30 nmol/L、100 nmol/L）能明顯抑制HCT116增殖(P＜0.05)，且呈現(xiàn)出劑量依賴性。③Real time RT-PCR結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染后48 h，100 nmol/L的piRNA-823 a

9、ntagomir能有效下調(diào)piRNA-823的表達（P＜0.05）。④流式細胞術結(jié)果顯示，抑制piRNA-823表達后，G1期的細胞數(shù)明顯增多(P＜0.001)，而S期和G2/M期的細胞數(shù)則相應下降（P＜0.01），表明抑制piRNA-823可以將HCT116細胞阻滯在G1期，抑制G1/S期轉(zhuǎn)換。⑤AnnexinⅤ/PI雙染結(jié)果顯示，抑制piRNA-823可導致凋亡細胞比例明顯升高(P＜0.001);TUNEL染色結(jié)果顯示，抑制piRN

10、A-823后，TUNEL染色陽性細胞率明顯升高（P＜0.001）;Western blot結(jié)果顯示，抑制piRNA-823可提高caspase-8、caspase-9及caspase-3的活性（P＜0.01）。以上結(jié)果表明，抑制piRNA-823可促進HCT116細胞凋亡。⑥平板克隆形成實驗和軟瓊脂克隆形成實驗均顯示，抑制piRNA-823表達后，HCT116細胞克隆形成能力明顯降低(P＜0.01)。⑦Western blot結(jié)果顯示，