長鏈非編碼基因CASC11在結(jié)直腸癌增殖、遷移中的作用和分子機制研究.pdf

1、目的:
　　本課題擬檢測CASC11在結(jié)直腸癌中的表達情況;分析其表達量的改變與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系;通過體內(nèi)外實驗，驗證其在結(jié)直腸癌中的功能作用;并研究CASC11在結(jié)直腸癌中的具體作用機制;探討CASC11異常表達的上游調(diào)控機制。
　　方法:
　　1.CASC11在結(jié)直腸癌組織及細胞中的表達情況
　　(1)采用熒光實時定量PCR(Real-time quantitative PCR，qRT-PCR)檢測36

2、例結(jié)直腸癌組織標本及其配對的正常組織中CASC11的表達。檢測CASC11在結(jié)腸癌細胞株SW480、SW620、HT29、LOVO、Ls174t、RKO、M5、HCT116和永生化結(jié)腸上皮細胞FHC中的表達情況。
　　(2)根據(jù)臨床樣本資料分析CASC11在組織樣品中的表達情況與腫瘤大小、分期和轉(zhuǎn)移等相關(guān)臨床病理參數(shù)的關(guān)系。
　　2.CASC11對結(jié)直腸癌體內(nèi)外生物學特性的影響
　　(1)將病毒轉(zhuǎn)染至SW480和SW6

3、20細胞中，建立穩(wěn)定干擾CASC11表達的SW480和SW620細胞亞系。將過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SW620、RKO細胞系中，構(gòu)建瞬時過表達CASC11的細胞亞系。并用qRT-PCR的方法進行驗證。
　　(2)通過CCK8細胞增殖實驗，平板克隆實驗，流式細胞術(shù)，Transwell實驗、劃痕實驗檢測干擾或過表達CASC11的細胞株體外增殖和遷移能力。
　　(3)將已構(gòu)建成功的穩(wěn)定干擾細胞株SW480-pLV-shCASC11和SW4

4、80-PLV-shNC注射至裸鼠皮下，4周后檢測腫瘤的大小以觀察CASC11穩(wěn)定干擾的細胞株在體內(nèi)的增殖能力;尾靜脈注射以建立CASC11干擾細胞株的體內(nèi)轉(zhuǎn)移模型，并于8周后檢測裸鼠肝臟和肺臟的轉(zhuǎn)移情況。
　　3.CASC11與靶基因之間的相互作用
　　(1)通過RNA-pull-down實驗拉下CASC11基因的結(jié)合蛋白，經(jīng)過銀染質(zhì)譜分析，結(jié)合文獻選出感興趣的結(jié)合蛋白不均一核糖體蛋白K(Heterogeneous ribo

5、nucleoprotein K，hnRNP-K)，并用Western blot和RIP實驗鑒定二者之間的結(jié)合。
　　(2)干擾或過表達CASC11，檢測hnRNP-K的表達量改變。觀察CASC11是否對hnRNP-K有調(diào)節(jié)作用。
　　(3)通過核漿RNA分離實驗，觀察CASC11在結(jié)腸癌細胞中的定位，根據(jù)其定位于胞漿或胞核結(jié)合相關(guān)文獻推測其功能機制。加入放線菌酮D后檢測CASC11的改變對hnRNP-K穩(wěn)定性的影響。

6、　　(4)改變hnRNP-K的表達，檢測CASC11表達的改變，觀察hnRNP-K是否對CASC11有反作用。
　　4.CASC11通過hnRNP-K對WNT通路活性的調(diào)節(jié)作用
　　(1)通過GSEA基因富集的方法，利用公共數(shù)據(jù)庫GEO數(shù)據(jù)分析結(jié)直腸癌中CASC11高表達組中上調(diào)的信號通路（WNT信號通路）。
　　(2)通過TOP/FOP雙熒光素酶報告基因檢測WNT活性改變，通過qRT-PCR和Westernblot檢

7、測WNT通路靶基因的改變。
　　(3)利用蛋白的核漿分離，檢測CASC11改變后β-catenin和hnRNP-K入核量的改變。并通過進一步改變hnRNP-K的表達情況，檢測CASC11對WNT信號通路的調(diào)節(jié)是否通過hnRNP-K起作用。
　　(4)通過COIP檢測hnRNP-K和WNT通路里重要蛋白的結(jié)合情況，初步推測hnRNP-K在WNT信號激活過程中的可能作用。
　　5.結(jié)直腸癌中CASC11的上游調(diào)控機制

8、>　　(1)TRANSFAC網(wǎng)站預(yù)測CASC11啟動子區(qū)域是否有c-Myc結(jié)合位點，并通過CHIP實驗和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞Cc-Myc是否能結(jié)合在CASC11啟動子部位并促進CASC11表達。
　　(2)上調(diào)或下調(diào)c-Myc表達后，用qRT-PCR技術(shù)檢測CASC11的表達情況，再次驗證c-Myc是否能作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)CASC11表達，并分析二者之間相關(guān)性。
　　(3)UCSC數(shù)據(jù)庫觀察CASC11啟動子部位有乙?；?/p>

9、變，并通過CHIP實驗證實乙?；课?。檢測c-Myc是否可以調(diào)節(jié)CASC11啟動子區(qū)乙?；M而調(diào)節(jié)CASC11的表達。
　　6.統(tǒng)計學分析
　　采用SPSS20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。
　　結(jié)果:
　　1.CASC11在結(jié)直腸癌組織和細胞中表達上調(diào)且與結(jié)直腸癌的大小、分期和浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　(1)CASC11在結(jié)直腸癌組織和細胞中表達上調(diào)
　　熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，在36對結(jié)直腸癌組織中，CA

10、SC11在結(jié)直腸癌組織中的表達有32對高于周圍正常粘膜組織(P＜0.001)。在結(jié)直腸癌細胞LOVO，M5，LS174t，RKO，SW620，SW480，HT29，HCT116中CASC11的表達均高于永生化結(jié)腸細胞FHC(P＜0.05)。
　　(2)CASC11表達水平和臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系
　　臨床病理分析結(jié)果顯示，CASC11的表達水平在年齡、性別和分化上沒有顯著差異(P＞0.05)，而在腫瘤大小、TNM分期、局部浸

11、潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移上有差異且具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2.CASC11在結(jié)直腸癌進展過程中的作用
　　(1)CASC11干擾和過表達載體的構(gòu)建
　　構(gòu)建了CASC11干擾的慢病毒載體和過表達CASC11的表達質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定結(jié)果顯示插入的序列正確，無突變、缺失或者框移。
　　(2)CASC11干擾和過表達對結(jié)直腸癌細胞增殖能力的影響
　　CCK8結(jié)果顯示，與對照組相比CASC11穩(wěn)定干擾的細胞生長速

12、度顯著下降(P＜0.001)，過表達的細胞生長速度則明顯快于對照組(P＜0.05)。
　　(3)CASC11干擾和過表達對結(jié)直腸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響
　　Transwell實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，CASC11干擾組細胞遷移數(shù)量明顯減少(P＜0.001)，而CASC11過表達組細胞遷移數(shù)量明顯增多(P＜0.05)。劃痕實驗結(jié)果顯示，CASC11干擾組細胞與對照組相比較，遷移速度明顯減慢（P＜0.001）。
　　3

13、.CASC11可以促進靶基因hnNRP-K的表達
　　(1)hnRNP-K是CASC11的靶基因
　　RNA-pull down結(jié)果顯示CASC11可以與hnRNP-K蛋白相結(jié)合，CASC11拉下的蛋白用hnRNP-K抗體做Westernblot驗證結(jié)果為陽性。用hnRNP-K抗體做RIP，結(jié)果顯示hnRNP-K抗體能結(jié)合CASC11的RNA。
　　(2)CASC11可以調(diào)節(jié)hnRNP-K的表達
　　CASC11

14、干擾的細胞株分別用qRT-PCR和Westernblot檢測SW480和SW620細胞中hnRNP-K的表達，實驗結(jié)果顯示hnRNP-K表達明顯降低，相反CASC11過表達則引起hnRNP-K的表達水平增高，說明CASC11可以調(diào)節(jié)hnRNP-K表達。
　　(3)CASC11可以增加hnRNP-K的穩(wěn)定性
　　(4)hnRNP-K對CASC11有反作用，二者之間具有相關(guān)性
　　在結(jié)直腸癌細胞株中干擾或過表達hnRNP-

15、K，做qRT-PCR可以引起CASC11的表達量出現(xiàn)相應(yīng)的改變，說明hnRNP-K對CASC11是有反作用的。
　　4.CASC11通過hnRNP-K激活WNT通路及下游的靶基因
　　(1)CASC11高表達的結(jié)直腸癌組織中信號通路分析
　　GSEA基因富集分析結(jié)果顯示，在基因芯片GSE8671數(shù)據(jù)中，WNT通路在CASC11高表達的結(jié)直腸癌中表達上調(diào)，并且通路相關(guān)基因富集(P＜0.05)。
　　(2)CASC1

16、1可以調(diào)節(jié)WNT通路活性及下游靶基因的表達
　　IHC和qRT-PCR結(jié)果均顯示在CASC11干擾后，WNT通路下游靶基因β-catenin，c-Myc，CycinD1和MMP7表達降低;增加CASC11表達量，則WNT通路下游靶基因β-catenin，c-Myc，CycinD1和MMP7表達隨之增高。
　　(3)CASC11通過hnRNP-K激活WNT通路
　　CASC11是通過hnRNP-K來起作用。
　　(

17、4)CASC11通過hnRNP-K激活WNT通路的可能機制
　　hnRNP-K可能在β-catenin入核的轉(zhuǎn)運或和TCF4結(jié)合中也起了作用。
　　5.結(jié)直腸癌中CASC11的上游調(diào)控機制
　　(1) c-Myc作為轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控CASC11的表達
　　(2) c-Myc能增強CASC11啟動子區(qū)域乙?；⑦M一步促進CASC11表達
　　結(jié)論:
　　1.CASC11在結(jié)直腸癌組織中表達增加，且與結(jié)直

18、腸癌的大小、漿膜浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分期相關(guān)，在結(jié)直腸癌中發(fā)揮癌基因的作用。
　　2.干擾CASC11表達抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖和遷移能力;過表達CASC11則促進腫瘤細胞的增殖和遷移。
　　3.hnRNP-K是CASC11的靶基因，CASC11通過增加hnRNP-K的穩(wěn)定性來促進其表達。hnRNP-K的表達對CASC11具有正反饋作用。
　　4.CASC11通過hnRNP-K激活WNT通路活性。
　　5.c-My