椎間盤髓核突出與交感性神經行為異常的實驗研究.pdf

1、選題的背景及目的:
　　隨著老齡化社會的到來，出現(xiàn)腰腿痛癥狀的患者逐漸增加，其中腰椎間盤突出是導致腰腿痛的重要原因之一。雖然目前有機械壓迫性因素、生物化學活性物質刺激、自身免疫炎癥反應等機制學說用于闡明腰椎間盤突出癥(lumbar disc herniation，LDH)腰腿疼痛癥狀的發(fā)病機制，但LDH肢體疼痛癥狀的具體發(fā)生機制仍不明確。
　　交感神經是人體自主神經系統(tǒng)的重要組成部分，大部分交感神經節(jié)后纖維為腎上腺素能纖維，

2、以去甲腎上腺素為遞質。有研究顯示通過采用切斷某些特定部位的交感神經纖維可以明顯緩解某些神經病理性疼痛，采用對交感神經阻滯的方法也能緩解因周圍神經損傷而引起的神經性疼痛癥狀。交感芽生是一種交感神經節(jié)后纖維在周圍神經損傷后向DRG內部感覺神經元生長、包繞的現(xiàn)象。大量研究發(fā)現(xiàn)背根神經節(jié)(Dorsalroot ganglion，DRG)內的交感神經芽生現(xiàn)象在神經病理性疼痛中可能發(fā)揮著重要作用。在通常情況下，DRG內的交感神經纖維僅分布于DRG內

3、穿行的血管表面，DRG內的感覺神經元對交感神經的興奮刺激也不敏感。但有學者在周圍神經損傷的動物模型中發(fā)現(xiàn)交感神經傳出纖維會向DRG內延伸生長，廣泛包繞感覺神經元，并可形成特殊的“籃狀結構”，具有“籃狀結構”的感覺神經元除具有較高的自發(fā)性放電頻率外，引起神經元放電所需的刺激閾值也出現(xiàn)降低。
　　臨床上有部分椎間盤突出癥患者會出現(xiàn)一些交感性神經異常相關癥狀，如出現(xiàn)肢體發(fā)涼，多汗或無汗等等，然而具體原因卻不清楚。大量研究表明DRG交感神

4、經芽生現(xiàn)象同神經病理性疼痛之間有著密切關系。椎間盤突出癥患者可以出現(xiàn)嚴重的神經痛癥狀，那么椎間盤突出癥與DRG交感神經芽生之間是否也存在著聯(lián)系，交感神經芽生是否也是導致椎間盤突出癥疼痛癥狀的因素之一呢？目前認為椎間盤髓核所引起的免疫炎癥反應可能是導致腰椎間盤突出癥神經病理性疼痛的重要原因之一，因此本研究旨在初步探尋單純椎間盤髓核突出與DRG內交感神經的聯(lián)系，及其對疼痛所產生的作用，以期進一步闡明椎間盤突出癥的發(fā)病機制，為椎間盤突出癥神經

5、病理性疼痛的臨床診治提供新的研究切入點。
　　研究方法:
　　首先，我們通過手術操作制作大鼠腰椎間盤髓核突出疼痛模型，其后觀察大鼠行為學改變，并通過檢測大鼠后足機械痛閾和熱痛閾的方法評估大鼠痛閾變化。然后，我們取出模型大鼠的DRG進行切片和免疫組化（immunohistochemistry，IHC）染色，觀察DRG內交感神經纖維形態(tài)和分布上的變化。最后，我們通過采集DRG切片的IHC染色照片，應用圖像分析軟件對切片內交感神經

6、纖維數量進行評估測定，并通過統(tǒng)計學方法進行數據分析。
　　一、腰椎間盤髓核突出大鼠模型的制備
　　1.動物分組:
　　本課題采用SD大鼠制作動物模型，大鼠價格低廉，純合性也相對較好，并且基因也較為接近人類，是目前國際上比較常用的椎間盤突出動物模型。本課題共采用110只雄性SD大鼠，體重約為250-300g。隨機抽取其中10只作為空白對照組，另外100只采用數字表法隨機分為髓核(nucleus pulposus，NP)處

7、理組（手術組）和非髓核處理組（假手術組），按照術后2、5、7、14、20天五個時間節(jié)點，每組每個時間節(jié)點10只進行分組。
　　2.制備方法:
　　各組大鼠均用3％濃度的戊巴比妥鈉按50mg/kg的劑量進行腹腔內注射麻醉。手術組將大鼠尾部近端切開，暴露尾椎間盤并刺破纖維環(huán)使髓核突出，用刮匙取出髓核后縫合創(chuàng)口。于大鼠背側做正中切口，剝離椎旁肌肉，切除左側椎板及部分椎間關節(jié)暴露L5左側背根神經節(jié)，將自體髓核放置于背根神經節(jié)表面后縫

8、合切口。假手術組僅切除L5左側椎板，并不取出、放置尾部椎間盤髓核。
　　二、大鼠痛閾檢測
　　1.大鼠機械性痛閾檢測:
　　利用Von Frey纖維絲檢測各組大鼠模型各個時間節(jié)點后足的機械性痛閾變化情況。
　　2.大鼠熱痛閾檢測:
　　利用熱輻射痛覺測量儀檢測各組大鼠模型各個時間節(jié)點后足的熱痛閾變化情況。
　　三、大鼠DRG內交感神經形態(tài)和數量變化
　　1.大鼠灌注固定及標本取材:
　　將

9、正常組、手術組及假手術組大鼠在各時間節(jié)點痛閾測試進行完畢后分別進行心室灌注固定處死。用約300ml的4％多聚甲醛行左心室灌注。沿大鼠背側原縱行切口切開，暴露左側L5背根神經節(jié)并取出。脫水后固定后將背根神經節(jié)用冰凍切片機切片，切片厚度約30um。
　　2.切片免疫組化染色染色及觀察:
　　DRG切片分別在1∶200稀釋的TH抗體及生物素化的二抗中孵育，并使用VECTASTAIN(@)ABC試劑孵育切片。在IHC染色過程中使用T

10、riton-X100以保證更好地促使抗體與抗原相結合。DAB顯色，脫水風干，中性樹膠封片后放置于光學顯微鏡下觀察。
　　3.交感神經纖維含量測定
　　隨機抽取每個DRG切片中的三分之一于顯微鏡下觀察拍照，并通過圖像分析軟件ImageJ1.47v對DRG中的交感神經纖維含量進行測量。通過將圖像分析軟件測得的交感神經纖維長度總和除以測量面積計算交感神經密度的方法來估測DRG內交感神經纖維含量。
　　四、大鼠DRG內NGF及

11、BDNF含量變化
　　1.大鼠模型制備及分組:
　　雄性健康SD大鼠30只分為手術組(NP處理組)、假手術組（非NP處理組）和正常組。采取隨機數字表隨機分組的方法對各組大鼠進行隨機分組，每個組10只。按照前述方法建立L4及L5雙節(jié)段NP突出模型。
　　2.DRG樣本取材:
　　術后7天，各組大鼠處死。手術取出術側L4及L5兩個節(jié)段DRG，裝入容器內，標記后-70℃冰箱內保存。
　　3.ELISA測定樣本NG

12、F及BDNF含量:
　　采用酶聯(lián)免疫法（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）測定正常組大鼠、NP處理組大鼠及非NP處理組大鼠DRG內NGF及BDNF含量并統(tǒng)計分析結果。
　　實驗結果:
　　一、大鼠模型后足機械性痛閾和熱痛閾降低
　　1.手術組及假手術組大鼠術后1周內有明顯行為學改變，大鼠出現(xiàn)術側后足抬高、避免著地負重及舔撫術側后足現(xiàn)象，NP處理組大鼠表現(xiàn)得更為明顯、

13、頻繁。術后5天內，NP處理組及假手術組術側后足機械性痛閾低于正常組大鼠，NP處理組大鼠在術后7、14、20天的機械性痛閾水平低于假手術組和正常組(P＜0.05)。
　　2.大鼠術后5天內，NP處理組及假手術組術側后足的熱痛閾值低于正常組大鼠。NP處理組大鼠于術后7、14、20天熱痛閾水平明顯低于假手術組和正常組(P＜0.01)。
　　二、大鼠模型DRG內交感神經向內部生長
　　1.正常組大鼠背根神經節(jié)切片經免疫組化染色

14、后，通過在顯微鏡下觀察，僅可見少量棕染的交感神經纖維，且所見交感神經纖維較為細小，并多分布于背根神經節(jié)外周部位。
　　2.髓核處理組大鼠背根神經節(jié)切片經免疫組化染色后，通過在顯微鏡下觀察，可見棕染的交感神經纖維數量增粗、增多，并向背根神經節(jié)內部感覺神經元之間伸入生長，大量感覺神經元被交感神經纖維所包繞。
　　三、大鼠模型DRG內交感神經數量明顯增加
　　采集的背根神經節(jié)切片照片通過應用ImageJ圖像分析軟件進行量化分

15、析后發(fā)現(xiàn)，經髓核(NP)移植處理的大鼠背根神經節(jié)切片內交感神經纖維數量要顯著高于正常組和非NP處理組DRG內所含交感神經纖維數量。
　　四、大鼠DRG內NGF及BDNF含量變化
　　結果顯示術后7天，手術組大鼠DRG內NGF含量明顯高于正常組和假手術組。術后7天，手術組大鼠DRG內BDNF含量低于正常組和假手術組。
　　結論:
　　一、在單純自體椎間盤髓核刺激DRG的情況下，可導致大鼠出現(xiàn)痛性行為異常及術側肢體痛