大鼠退變性髓核突出誘致神經(jīng)根性疼痛及其機制研究.pdf

1、第一部分：大鼠尾椎纖維環(huán)穿刺法建立椎間盤退變模型的研究
　　 研究背景：
　　 下腰痛(Low Back Pain)是現(xiàn)代社會中極為常見的疾患，80％以上的人一生中曾有過下腰痛的經(jīng)歷，給社會和家庭均造成了沉重的負擔。下腰痛病因復雜，其中椎間盤退變(Intervertebral Disc Degeneration,IDD)及其繼發(fā)的一系列疾病，如腰椎間盤突出癥、椎間盤源性疼痛、腰椎管狹窄癥及退變性腰椎滑脫癥等被公認為是導致

2、下腰痛的主要原因。我國人口眾多且社會老齡化逐年加劇，對腰腿痛病人的診治、康復及由此引起的勞動力喪失給全社會帶來了沉重的負擔，導致了眾多患者生活質量的嚴重下降；重視椎間盤退變性疾病的基礎與臨床研究具有十分重要的現(xiàn)實意義。近年眾多學者提出了各種以逆轉或再生退變椎間盤為目的的生物治療方法，包括基因治療、細胞移植、生長因子直接注射等。而無論是評價與篩選各種新型生物治療手段的效果，還是深入研究椎間盤退變的病理生理機制，選擇與構建合適的動物模型都具

3、有十分重要的意義，是進行椎間盤方面研究的基礎。
　　 大鼠等嚙齒類動物以其易于獲得、適合多種實驗目的、可耐受手術創(chuàng)傷、飼養(yǎng)方便且成本較低的優(yōu)點，在眾多研究中得到了廣泛應用，是最常用的椎間盤退變動物模型之一。既往研究中多采用特殊的機械持續(xù)加壓裝置改變大鼠脊柱生物力學環(huán)境的方法來達到引起椎間盤退變的目的，但操作復雜，不適合較多數(shù)量的篩查實驗。而直接利用穿刺針損傷纖維環(huán)的辦法具有操作微創(chuàng)、可控性與可重復性好的優(yōu)點，已在兔、羊、豬等多種

4、動物模型中得到廣泛應用，但用于大鼠尾椎這一特殊解剖部位的研究尚剛剛起步。
　　 目的：
　　 建立一種操作簡便、效果可靠的大鼠尾椎椎間盤退變模型，同時也為下一部分的課題提供退變的尾椎間盤髓核組織。
　　 方法：
　　 定位大鼠尾椎的Co4/5及Co8/9椎間隙，無菌條件下分別做一個長度約0.5cm的小切口，切開皮膚、皮下組織直接顯露白色的椎間盤，然后用21 G的注射器針頭平行于終板刺入纖維環(huán)，深度以尖端夾

5、持的血管鉗控制在3mm。刺入后緩慢旋轉360度，再停留約30秒鐘后拔出。3-0絲線縫合皮膚。術后2周應用X線、MRI及組織學(蘇木素-伊紅)染色觀察評估退變發(fā)生情況。
　　 結果：
　　 穿刺手術后2周，與空白對照及假手術組椎間盤相比，在X線片上穿刺椎間隙高度指數(shù)并沒有發(fā)生明顯變化(P=0.246)。術后尾椎MRI顯示，在T2加權像上，無論是與未手術的相鄰節(jié)段還是與其它對照組椎間盤相比，穿刺后的椎間盤信號強度都明顯降低。

6、各組動物的Pfirrmann分級差異明顯，空白對照組椎間盤基本均屬完全正常的Ⅰ級表現(xiàn)，假手術組有少數(shù)椎間盤稍有退變改變，而穿刺組各個節(jié)段都發(fā)生了明顯的改變，其中Pfirrmann分級Ⅲ級表現(xiàn)最多，有6個，Ⅱ級與Ⅳ級表現(xiàn)各為2個椎間盤，但沒有出現(xiàn)非常嚴重退變的Ⅴ級表現(xiàn)。蘇木素-伊紅染色發(fā)現(xiàn)：對照組及假手術組大鼠尾椎椎間盤內結構比較完整，髓核與纖維環(huán)分界清楚，橢圓形髓核組織占據(jù)了整個尾椎間盤面積2/3以上的區(qū)域，排列較緊密的髓核細胞分布較均

7、勻；纖維環(huán)結構齊整、排列規(guī)則，各層纖維軟骨板呈同心圓狀分布，無裂痕，成纖維細胞間斷分布其間。而在穿刺后2周的椎間盤呈較為明顯的退變性改變，即髓核組織面積逐漸縮小，約占整個椎間盤區(qū)域的一半以下，與纖維環(huán)之間的連續(xù)性中斷、空隙增寬；髓核細胞盡管仍是軟骨細胞樣外觀，但數(shù)目減少，出現(xiàn)明顯的空泡樣變性，著色稍淡，細胞外基質分散，部分髓核被纖維樣物質所取代。纖維環(huán)失去了規(guī)整的同心圓結構，排列紊亂，出現(xiàn)明顯的向心性裂隙，顏色稍淡染，纖維環(huán)中成纖維細胞

8、減少而類軟骨樣細胞分布增多。各組中的上下終板染色沒有發(fā)現(xiàn)明顯區(qū)別。
　　 結論：
　　 大鼠尾椎椎間盤易于顯露，操作方便，是建立椎間盤退變動物模型的一個較好選擇。采用21 G穿刺針進行纖維環(huán)穿刺的方法在術后2周可以引起明確的椎間盤退變改變。
　　 第二部分：大鼠正常與退變性髓核突出誘致神經(jīng)根性疼痛的對比及其機制研究
　　 研究背景：
　　 腰椎間盤退變及其繼發(fā)的系列病理改變是引起患者腰腿痛的主要原

9、因。椎間盤退變方面的基礎研究是脊柱外科領域的關注熱點，如探討退變的病理生理機制、以修復或再生退變椎間盤為目的的各種生物治療等近年來得到了廣泛研究。從臨床角度出發(fā)，深入研究腰腿痛的發(fā)生機制與椎間盤退變之間的聯(lián)系具有十分重要的意義。對椎間盤退變各種動物模型的建立以及生物治療方法的驗證等只有考慮到與疼痛相聯(lián)系時才更具實際意義。
　　 鑒于人類感知疼痛的復雜性與主觀性，決定了很難利用動物模型來精確模擬和評價評價腰痛這樣的軸性痛，因此目前

10、在疼痛方面的研究多利用了實驗性椎間盤髓核突出或其他機械因素壓迫引起的神經(jīng)根性疼痛模型來代替，以模擬臨床上最常見的腰椎間盤退變性疾病——腰椎間盤突出癥的發(fā)生。近年來大量研究表明：除機械壓迫因素外，與椎間盤髓核有關的炎性化學因子所造成的刺激，是引起神經(jīng)功能受損害或產(chǎn)生疼痛的重要原因。但既往這些研究都是直接利用自體或者是異體的髓核組織進行移植，而在臨床上，絕大部分腰椎間盤突出癥的患者都伴有明顯的退變改變，表現(xiàn)為MRI上信號降低或“黑盤征”。已

11、發(fā)生退變的椎間盤組織與正常的椎間盤無論是在形態(tài)結構、生化成分還是在多種細胞因子含量等方面都有明顯差異，因此，有必要利用退變性髓核突出導致神經(jīng)根性疼痛的模型來研究椎間盤退變與疼痛之間的關系并進行機制方面的探討。
　　 目的：
　　 探討大鼠正常與退變性髓核突出誘致神經(jīng)根性疼痛的不同，研究椎間盤退變與神經(jīng)根性疼痛之間的關系；探討腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及其受體(TNFR1及TNFR2)在疼痛進展過程中的作用。
　

12、　 方法：
　　 利用尾椎椎間盤纖維環(huán)穿刺的方法建立椎間盤退變模型后，分別取出自體的退變髓核與正常髓核組織，置于手術顯露后的腰5左側神經(jīng)根處，建立髓核突出導致神經(jīng)根性疼痛模型。分別在術后1，4，7，10，14和21天采用行為學測試的方法檢測兩組大鼠的運動功能、機械刺激閾值與熱刺激閾值；分別在術后第4與14天采用免疫組化的方法檢測兩組的腰5左側背根神經(jīng)節(jié)中TNF-α的表達。在退變性髓核突出導致神經(jīng)根疼痛模型后，分別在術后1，4，

13、7，10，14和21天采用蛋白免疫印跡(Western Blot)檢測背根神經(jīng)節(jié)中TNFR1和TNFR2的表達變化。
　　 結果：
　　 所有4組實驗動物手術前后均沒有出現(xiàn)跛行、步態(tài)異?；虬c瘓的現(xiàn)象，運動損害功能評分為0分。對照組和假手術組動物沒有出現(xiàn)明顯的機械痛覺過敏現(xiàn)象；而無論是正常還是退變髓核移植組大鼠都出現(xiàn)了手術側(同側)后肢的機械刺激閾值明顯降低-逐漸恢復的一個過程，且痛覺過敏的現(xiàn)象一直持續(xù)到術后第10～14天

14、之間結束。同時，通過對術后某一時間點的組間對比發(fā)現(xiàn)，在手術后的第1、4、7天，移植退變髓核的N-NP組大鼠機械性閾值比P-NP組更低(P值分別為0.038，0.021和0.038，均＜0.05)，表明該組的機械性痛覺過敏程度更重。手術對側盡管在特定的時間點也有疼痛過敏的發(fā)生，沒有發(fā)現(xiàn)規(guī)律性的變化過程。與機械性刺激的結果不同，術后的熱刺激閾值沒有呈現(xiàn)規(guī)律性變化。與手術前相比，在手術側僅有下列時間點存在統(tǒng)計學差異：P-NP組：手術后1天(P

15、=0.017)；N-NP組：手術后第4天(P=0.025)與第10天(P=0.042)。手術對側沒有發(fā)現(xiàn)明顯的閡值降低。對照組和假手術組切片陽性染色很少。相比之下，兩種髓核移植組在術后第4及14天都觀察到了DRG中TNF-α表達量的顯著升高，強陽性染色主要位于神經(jīng)元胞漿，分布比較均勻；間質細胞也有部分陽性表現(xiàn)。計數(shù)切片顯微鏡視野內陽性染色細胞的數(shù)目并做比較發(fā)現(xiàn)，N-NP組與P-NP組之間相比，陽性細胞數(shù)目在兩個時間點都沒有發(fā)現(xiàn)顯著性差異

16、(第4天P=0.252，第14天P=0.146)。對退變性髓核移植組DRG中兩種TNFR蛋白的表達研究發(fā)現(xiàn)，TNFR-1在術后早中期持續(xù)維持在較高水平(10 d內)，與疼痛過敏進程相關；而TNFR-2除在術后的早期(1 d)有高表達外，還在痛覺過敏恢復后(14 d、21 d)有高表達。
　　 結論：
　　 1.大鼠自體尾椎椎間盤髓核移植到腰5神經(jīng)根可以引起明顯的機械性痛覺過敏現(xiàn)象發(fā)生。
　　 2.與正常髓核組織相