低壓低氧時Th17細(xì)胞的變化特點及其與肺血管改建的關(guān)系.pdf

1、研究背景及目的:
　　HPH是一種低氧所引起的慢性進行性疾病，主要有持續(xù)肺動脈壓力升高、并伴有右心室肥大及肺血管結(jié)構(gòu)改建等特點。在高原心臟病(High Altitude Heart Disease，HAHD)發(fā)病的過程中HPH所扮演的角色非常關(guān)鍵。HAHD作為慢性高原病患者重要的死亡原因，也是高原上的常見疾病。因此，HPH及其發(fā)病機制的探索一直是高原醫(yī)學(xué)研究的重點與熱點。由于HPH的發(fā)病機制尚不完全清楚，迄今尚缺乏有效的預(yù)防及治療

2、措施。以往研究發(fā)現(xiàn)，HPH的發(fā)生發(fā)展中炎癥免疫反應(yīng)發(fā)揮有重要作用，但具體機制仍有待完善。
　　Th17細(xì)胞是一類具有強大的致炎性的細(xì)胞，有研究表明，其在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。Th17細(xì)胞隸屬于CD4+T輔助細(xì)胞系，作為一種CD4+T輔助細(xì)胞的新亞型，它不同于Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞。低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factors，HIFs)是低氧反應(yīng)的氧感知信號途徑中的關(guān)鍵分子，能介導(dǎo)低氧性肺血管改建等多種低氧

3、反應(yīng)。HIF-1的上調(diào)與激活可促進幼稚T細(xì)胞(Na(i)ve T cell)向Th17細(xì)胞分化，抑制其向Treg分化。HIF-1通過STAT3途徑，可直接激活Th17細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)孤獨受體（RORγt），并參與調(diào)控Th17的功能。
　　白介素-17(Interleukin-17)是Th17細(xì)胞的主要效應(yīng)因子，促進炎癥反應(yīng)是IL-17的主要生物學(xué)效應(yīng)。IL-17在促進T細(xì)胞活化、募集及活化中性粒細(xì)胞中具有重要作用，其

4、次，IL-17還能刺激纖維細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的增殖，以此來增加膠原沉積，介導(dǎo)組織炎癥反應(yīng)。近年來，多項研究表明，已在慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘(Asthma)等慢性炎癥性疾病和多種自身免疫性疾病中發(fā)現(xiàn)了Th17細(xì)胞的身影，并在其中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。
　　因此，本研究采用低壓低氧暴露復(fù)制小鼠HPH模型，利用該動物模型，探討低壓低氧暴露后Th17細(xì)胞的變化特點及其與肺血管改建之間的關(guān)系。以更深一步揭示HPH及其發(fā)病機制，為尋求關(guān)鍵

5、有效的HPH防治靶點提供線索和依據(jù)。
　　方法:
　　1.動物分組
　　雄性Balb/c小鼠50只，按低氧暴露時間差異隨機分為5組，每組10只。低壓低氧組小鼠分別置與模擬海拔6000m的低壓艙內(nèi)飼養(yǎng)3、7、14、28 d。常氧組即0d組，置常壓常氧環(huán)境下飼養(yǎng)。動物常規(guī)飼養(yǎng)，實驗前12h禁食，自由飲水。采用持續(xù)性低壓低氧方法復(fù)制HPH模型，即低氧處理組小鼠置于低壓氧艙內(nèi)24h連續(xù)低壓低氧處理不同時間后檢測所需指標(biāo)。

6、>　　2.檢測方法
　　于相應(yīng)時間點通過心導(dǎo)管檢測右室收縮壓(RVSP)，隨后快速處死取材，測量右心室重量(RVHI)指數(shù);Masson染色肺組織石蠟切片，觀察肺血管改建及細(xì)胞外基質(zhì)沉積情況;流式細(xì)胞術(shù)檢測脾臟組織及肺組織中Th17細(xì)胞(CD4+IL-17+RORγt+)所占比例變化;ELISA檢測血清中IL-4、IL-6、IL-17水平及肺組織中IL-17水平變化;Western blot檢測肺組織中RORγt蛋白表達(dá)情況;RT

7、2-PCR檢測肺組織RORγt的mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.RVSP及RVHI的變化
　　RVSP及RVHI檢測結(jié)果表明，低氧暴露7d、14d、28 d后小鼠右心室收縮壓(RVSP)和右心肥厚指數(shù)(RVHI)明顯高于對照組。差異顯著且具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。
　　2.小鼠血清細(xì)胞因子的變化
　　ELISA檢測結(jié)果顯示，低壓低氧后各組小鼠血清IL-4、IL-6水平較常氧對照組

8、明顯升高，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。低壓低氧7d、14 d、28 d組血清的IL-17水平與常氧對照組相比顯著升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　3.脾臟組織Th17細(xì)胞比例的變化
　　流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，在低氧誘導(dǎo)下，脾臟組織中IL-17+ RORγt+CD4+T細(xì)胞百分比隨缺氧時間的增長呈上升趨勢，14 d、28 d組與對照組差異顯著且有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　4.肺

9、組織RORγt的mRNA水平
　　RT2-PCR結(jié)果顯示，在低氧誘導(dǎo)下，肺組織中RORγt的mRNA表達(dá)明顯升高，7d、14d、28 d組與常氧對照組相比有差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。
　　5.肺組織IL-17水平
　　ELISA結(jié)果顯示，低氧暴露14d、28 d組與對常氧照組相比，肺組織中IL-17水平顯著升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。
　　6.肺組織RORγt蛋白水平表達(dá)

10、升高
　　Western blot結(jié)果可以看出，低氧誘導(dǎo)下，肺組織中RORγt的蛋白表達(dá)水平升高，與對照組相比有差異且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。
　　7.肺組織Th17細(xì)胞比例的變化
　　流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，在低氧誘導(dǎo)下，肺組織中Th17細(xì)胞的水平明顯呈上升趨勢，與對照組相比顯著升高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。
　　8.相關(guān)性分析
　　肺組織中RORγt的m

11、RNA表達(dá)水平、IL-17表達(dá)量與心室收縮壓、右室肥厚指數(shù)呈顯著正相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.低壓低氧可使脾臟Na(i)ve T細(xì)胞向Th17分化。
　　2.肺組織中RORγt的mRNA表達(dá)水平及IL-17水平顯著升高。提示低壓低氧時肺組織中浸潤的Th17細(xì)胞增多。
　　3.小鼠在模擬海拔6000 m低壓低氧環(huán)境生存7d即可造成RVSP和數(shù)RVHI明顯升高，肺血管周圍沉積的膠原纖維增多。
　　4.低壓低氧時