Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)及與腫瘤進(jìn)展的關(guān)系.pdf

1、目的：研究Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞在原發(fā)性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)患者中的表達(dá)情況，探討在PHC中是否存在Treg和Th17的平衡以及Th17、Treg和Treg/Th17與原發(fā)性肝癌病理發(fā)展的關(guān)系；研究Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的相互作用，探討腫瘤微環(huán)境中相關(guān)細(xì)胞因子和細(xì)胞直接接觸作用(包括共刺激分子和T細(xì)胞第一信號等)對Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的作用，以期探索Th

2、17細(xì)胞、Treg細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的相互作用機(jī)制。
　　 方法：采用流式細(xì)胞儀分析的方法測定93例PHC患者外周血中Th17和Treg的比例分布狀況，采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time PCR)的方法檢測外周血中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞分化增殖相關(guān)的因子IL-1R、IL-6、IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-23p19、TGF-β、RORc和Foxp3mRNA水平的表達(dá)。分析研

3、究對象的相關(guān)臨床資料，包括：性別、年齡、術(shù)前甲胎蛋白(AFP)濃度、腫瘤直徑、腫瘤個數(shù)、是否有門靜脈癌栓、是否出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等等指標(biāo)，探討PHC患者外周血Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例分布與研究對象各項(xiàng)臨床指標(biāo)間的關(guān)系。采用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin sTAining，HE)染色法，分析炎性細(xì)胞在原發(fā)性肝癌患者肝組織的浸潤情況。采用帶有熒光標(biāo)記的抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，直觀分析Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞在原發(fā)性肝癌

4、患者肝臟組織的分布。分離出CD4+T細(xì)胞、CD4+CD25+Treg細(xì)胞、CD4+CD25-T細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、非腫瘤細(xì)胞(為排除CD14+單核-巨噬細(xì)胞的影響，從腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞中分離除去CD14+細(xì)胞)，以直接接觸和transwell小室隔離的方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。用流式細(xì)胞儀檢測腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞胞膜上共刺激分子CD80、CD86和ICOSL(CD275)等的表達(dá)，并以相應(yīng)的中和抗體進(jìn)行阻斷，觀察阻斷后Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的

5、變化。為排除細(xì)胞直接接觸中細(xì)胞因子的作用，腫瘤細(xì)胞經(jīng)150 gray的γ射線照射致死，不再分泌細(xì)胞因子，僅僅提供細(xì)胞直接接觸作用。研究中統(tǒng)計分析采用SPSS16.0軟件。
　　 結(jié)果：93例PHC患者外周血標(biāo)本中Th17、Treg數(shù)量以及Treg/Th17明顯高于正常對照組(4.621％±0.856％vs3.148％±0.716％，P＜0.0001；8.618％±1.939％vs4.967％±1.075％，P＜0.0001；1.

6、878％±0.402％vs1.621％±0.315％，P＜0.0001)，且差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.0001)。Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞呈正向直線關(guān)系(r=0.5132，P＜0.001)。多元線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，PHC患者外周血中Th17、Treg數(shù)量與患者TNM分期密切相關(guān)聯(lián)系(t=2.494，P=0.015；t=2.261，P=0.027)。PHC患者不同TNM分期(Ⅰ期11例、Ⅱ期28例和Ⅲ期40例、Ⅳ期14例)外周血中T

7、h17細(xì)胞、Treg細(xì)胞數(shù)量以及Treg/Th17比值不同(Ⅰ期＜Ⅱ期＜Ⅲ期＜Ⅳ期；Th17細(xì)胞：4.07％±0.746％＜4.286％±0.7％＜4.867％±0.84％＜5.02％±0.87％；Treg細(xì)胞：6.767％±1.283％＜7.934％±1.452％＜9.155％±1.840％＜9.97％±1.974％：Treg/Th17：1.694±0.375＜1.865±0.325＜1.880±0.393＜2.059±0.535)；

8、將Ⅰ期和Ⅱ期稱為早期階段，Ⅲ期和Ⅳ期稱為進(jìn)展階段也就是晚期，其中早期和晚期階段的Th17和Treg細(xì)胞數(shù)量在統(tǒng)計學(xué)上有顯著差異(Ⅰ期-Ⅱ期＜Ⅲ期-Ⅳ期；Th17：4.225％±0.710％＜4.907％±0.843％；Treg：7.605％±1.489％＜9.366％±1.891％；P＜0.001)；而Treg與Th17的比值雖然晚期高于早期(1.817±0.344＜1.926±0.436)但在本研究中早晚期之間相比較卻無統(tǒng)計學(xué)差異(P

9、＞0.05)。激光共聚焦顯微鏡觀察到Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞在腫瘤局部的聚集。腫瘤組織分離得到的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)，非腫瘤組織分離得到的非腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(NIL)，Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例在TIL中高于NIL(P＜0.05)，高于自身外周血中Th17和Treg百分比(如：Th17：18.99％＞6.70％＞4.83％；Treg：19.48％＞9.25％＞5.28％)。分離得到的CD4+T細(xì)胞與自身腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞共

10、培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞可以促進(jìn)Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞增多。進(jìn)一步將CD4+T細(xì)胞與自身腫瘤細(xì)胞以直接接觸或以transwell小室隔離的方式共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞均增多，但直接接觸的培養(yǎng)方式的促進(jìn)作用更強(qiáng)。在transwell小室隔離共培養(yǎng)體系中，單獨(dú)或聯(lián)合加入IL-23p19、IL-6和TGF-β中和抗體作用后，Th17細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的下降，阻斷TGF-β后Treg細(xì)胞出現(xiàn)小幅度的降低；在細(xì)胞直接接觸共培養(yǎng)體系中，

11、單獨(dú)或聯(lián)合加入CD80、CD86和ICOSL(CD275)中和抗體作用后，Th17細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的下降，但阻斷后Treg細(xì)胞反而出現(xiàn)不同程度的升高。經(jīng)150 gray的γ射線照射致死的腫瘤細(xì)胞仍然可以促進(jìn)Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的增高。分離純化的CD4+CD25+Treg細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后，可以檢測出CD4+IL-17+Th17細(xì)胞；CD4+CD25-T細(xì)胞與自身腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后可以檢測到CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞。

12、>　　 結(jié)論：原發(fā)性肝癌外周血中Th17和Treg比例分布與腫瘤TNM分期密切相關(guān)，而且Th17和Treg的百分比隨TNM分期增加而增加且成正向直線相關(guān)的關(guān)系，Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例在TIL中高于NIL，這或許說明Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)、越高比例的Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞腫瘤越是惡化。Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞呈正向直線關(guān)系。腫瘤細(xì)胞可以通過分泌細(xì)胞因子和細(xì)胞直接接觸的方式促進(jìn)Th17細(xì)胞和Treg細(xì)