核激素受體和乙肝功能性受體支持HBV感染非肝源細(xì)胞.pdf

1、背景和目的：乙型肝炎病毒（HBV）的感染目前是全球性的健康問題，據(jù)報(bào)道，約有20億人口曾經(jīng)感染過HBV,其中慢性乙型肝炎感染人數(shù)約為3.5億，每年都有近百萬人死于HBV感染所導(dǎo)致的肝硬化、肝癌等疾病。因此，研究HBV的感染、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制機(jī)制以及研發(fā)有效的乙型肝炎治療藥物及方法刻不容緩。然而現(xiàn)階段缺乏能夠研究HBV-宿主之間相互作用的細(xì)胞模型。有研究發(fā)現(xiàn)，鈉離子/牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Na+/taurocholate Cotransporti

2、ng Polypeptide NTCP）是HBV和HDV功能性受體。NTCP能夠與HBV-PreS1特異性結(jié)合，從而介導(dǎo)HBV侵入和感染宿主細(xì)胞。敲除NTCP能夠抑制HBV和HDV的感染，而外源性NTCP的表達(dá)，使不易感染的肝癌細(xì)胞對(duì)HBV、HDV敏感。核激素受體肝細(xì)胞核因子4（HNF4）和類視黃醇X受體(Retinoid X Receptors,RXRs)和過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-a

3、ctivated receptor,PPAR)能夠支持HBV前基因組RNA(pgRNA)在非肝源細(xì)胞中的合成，這些核激素受體（NRs）能夠調(diào)控病毒基因的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。綜合這些研究結(jié)果，我們提出研究假設(shè)，HBV功能性受體和核激素受體能支持HBV感染非肝源細(xì)以及HBV在非肝源細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄復(fù)制。
　　方法：將表達(dá)HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞中，培養(yǎng)120h，取細(xì)胞上清液，并提取上清液中病毒顆粒中的DNA檢測(cè)拷貝數(shù)，作為本實(shí)驗(yàn)所細(xì)胞感染所

4、需用的病毒液。將表達(dá)NTCP和NRs的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，用病毒液感染此細(xì)胞。數(shù)日后使用時(shí)間分辨熒光檢測(cè)細(xì)胞上清液中HBsAg濃度，提取細(xì)胞DNA、RNA，PCR-Southern blot檢測(cè)HBV cccDNA、qPCR檢測(cè)HBV pgRNA來判斷細(xì)胞是否被感染及HBV在胞內(nèi)是否進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。
　　結(jié)果：轉(zhuǎn)染NTCP和NRs的293T細(xì)胞經(jīng)過HBV感染72h后，用時(shí)間分辨熒光檢測(cè)細(xì)胞上清液中HBsAg濃度達(dá)到陽性指標(biāo)。