不同種類干細胞靜脈輸注對2型糖尿病大鼠治療效果的比較及機制研究.pdf

1、研究背景
　　2型糖尿病(T2DM)是一種慢性炎性疾病，其發(fā)病機制核心為胰島素抵抗和漸進性胰島β細胞功能衰退，同時還涉及免疫失衡和胰島α細胞功能亢進等其他病理生理過程。而干細胞因其可分泌多種生長、調節(jié)因子并具有多向分化潛能的特性，促使多項臨床及基礎研究在干細胞輸注治療糖尿病領域進行了有益的探索。
　　選取何種干細胞、以達到最優(yōu)的治療效果，一直是研究者們最為關注的問題。骨髓造血干細胞或骨髓單核細胞輸注已被多項研究證實對T1DM

2、和T2DM療效確切，可降低血糖并改善胰島功能;但雖然其效果明顯，也具有不可避免的缺點:骨髓干細胞的獲取為有創(chuàng)性操作，且患者自體骨髓造血干細胞的增殖、分泌能力會因長期處于高糖環(huán)境而受損;但若采用異體骨髓干細胞輸注，則又面臨著免疫抑制劑的使用及藥物副作用等問題。因此，越來越多的研究者們也將目光投向除骨髓造血干細胞外的其他種類干細胞，如免疫原性更低的骨髓間充質干細胞、來源更廣的脂肪間充質干細胞及無創(chuàng)性獲得的臍帶間充質干細胞及臍血單個核細胞等。

3、現(xiàn)有的臨床研究顯示，以上幾種干細胞均可起到一定的平穩(wěn)血糖的作用，但在改善胰島功能方面不同研究之間尚存在一定的不一致性，尤其在改善胰島功能方面。目前為止尚未有研究在同一試驗標準下比較不同干細胞對血糖控制及胰島功能的改善作用?？紤]到既往單一干細胞輸注的臨床研究結果的不一致性，為了達到為不同患者制定符合其病情的精準治療方案、篩選最優(yōu)的干細胞種類，因此在同一研究標準下比較不同干細胞輸注的有效性及各自療效側重就有很大臨床意義。
　　胰島是一

4、種高度血管化的組織，其體積占胰腺總體積的1-2％，但血流量卻占胰腺總血流的10-20％。鑒于此結構的特殊性，胰島可迅速感知血糖及激素變化，但也使其極易遭受氧化應激等有害刺激的損傷。一旦胰島微循環(huán)內皮的完整性及功能受損，將導致淋巴細胞的粘附、浸潤增加，從而加劇胰島的破壞:因此，保護胰島微循環(huán)與保護胰島β細胞功能一樣重要。間充質干細胞(MSC)已在多項臨床研究及動物試驗中被證實能夠改善糖耐量和胰島功能，但其具體是通過分泌何種因子、激活哪條通

5、路達到的以上療效，仍少有研究報道。
　　Wnt蛋白是一類與生長發(fā)育、細胞增殖遷移與干細胞干性維持及分化調節(jié)有關的重要因子，一般由干細胞及腫瘤細胞等分化程度較低的細胞分泌，正常狀態(tài)下的成熟細胞僅表達少量的Wnt蛋白，但在組織損傷修復的過程中可一定程度上調。以細胞種類不同及作用濃度不同，Wnt蛋白可激活不同的下游通路，即的β-catenin依賴性的經典Wnt通路，和β-catenin非依賴性的非經典Wnt通路。既往的研究已證實Wnt通

6、路的激活可促進病理/生理性的血管增生，并且在胰島β細胞中敲除β-catenin或其下游的TCF7L2均可導致胰島功能和形態(tài)學的異常，進而導致糖耐量受損。Wnt3a、Wnt4均可通過激活經典β-catenin依賴性Wnt通路促進β細胞增殖，而Wnt4對β細胞分泌卻沒有明顯影響?；谝陨涎芯拷Y果，我們合理假設MSC可以通過分泌Wnt蛋白、激活胰島β細胞及胰島微循環(huán)內皮細胞中的β-catenin通路，改善胰島功能和微循環(huán)內皮功能。
　　

7、研究目的
　　本研究旨在通過評估大鼠骨髓間充質干細胞(bmMSC)、人臍帶間充質干細胞(hucMSC)及臍帶血單核細胞(CBSC)單次或雙次輸注的治療效果，比較每種治療方案對糖尿病鼠血糖狀況、胰島功能、胰島素抵抗和慢性炎癥反應的影響，以期探討各種干細胞的治療側重，為臨床應用的干細胞選擇提供最優(yōu)方案，為干細胞個體治療方案的擬定提供依據(jù)。繼而我們通過bmMSC體外與胰島微循環(huán)內皮細胞MS-1及離體胰島的共培養(yǎng)，探討了MSC分泌的Wnt

8、蛋白和胰島內β-catenin依賴的Wnt通路對氧化應激損傷下的MS-1和胰島功能的作用。
　　研究方法
　　第一部分不同種類干細胞靜脈輸注對2型糖尿病大鼠治療效果的比較
　　1、通過高脂高糖飲食+小劑量STZ誘導2型糖尿病SD大鼠模型，每周監(jiān)測血糖，確定造模成功。于造模成功后7天，對T2DM大鼠進行隨機分組:T2DM、T2DM+bmMSC、T2DM+hucMSC、T2DM+CBSC。對于T2DM+hucMSC的部分大

9、鼠，于首次輸注干細胞后2周進行第二次干細胞治療，輸注HucMSC或CBSC。于第一次干細胞注射后2w、4w、8w分別進行IPGTT并尾尖取血測血糖、胰島素、胰高糖素，三天后處死，留取空腹血及各類臟器。
　　2、比較不同處理組的血糖控制情況:每周檢測1次鼠尾血糖。IPGTT采用腹腔注射葡萄糖1.5g/kg體重，大鼠用異氟烷麻醉，剪尾取血。
　　3、比較不同處理組的胰島功能及形態(tài)學變化:放免法檢測空腹胰島素/胰高糖素及IPGTT

10、后的胰島素/胰高糖素曲線變化。胰腺石蠟切片HE染色觀察胰島形態(tài)及大小改變。胰腺石蠟免疫組化染色觀察胰島素陽性區(qū)域大小及比例改變。胰腺石蠟免疫熒光染色觀察胰島素(+)/胰高糖素(+)區(qū)域比例及PCNA、胰島素雙陽性細胞在胰島素陽性細胞中的比例。
　　4、比較不同處理組的胰島素抵抗狀態(tài)改變:HOMA-IR、胰島素敏感性指數(shù)Matsuda index和胰島素敏感性指數(shù)Belfiore index評判大鼠胰島素抵抗狀態(tài)。同時肝臟Weste

11、rn blotting檢測p-AKT/t-AKT和p-Erk/t-Erk胰島素通路相關蛋白的表達趨勢。
　　5、比較不同處理組肝臟糖代謝的改變:提取肝臟蛋白，Western blotting檢測肝糖代謝關鍵酶糖原合成酶激酶(GSK3)、肝臟糖攝取關鍵蛋白葡萄糖轉運子2(GLUT2)、糖酵解關鍵酶丙酮酸激酶(PK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸脫氫酶激酶(PDK)及糖異生關鍵酶葡萄糖-6-磷酸異構酶（G-6-Pase）、磷酸烯醇丙

12、酮羧基酶-1(PCK1)的表達量。同時肝臟組織石蠟切片糖原染色，觀察糖原儲存量的改變。
　　6、比較不同處理組的脂代謝的改變:生化法檢測TC、TG、LDL、HDL和FFA。
　　7、比較不同處理組的血清學代謝指標及炎性因子的變化差異:ELISA法檢測IL-1b、IL-6、IL-17、IL-22、TNF-α及IFN-γ。
　　第二部分 MSC改善胰島及胰島微循環(huán)內皮細胞功能的機制研究
　　1、通過H202刺激構建大

13、鼠離體胰島及胰島微循環(huán)內皮細胞MS-1的氧化應激損傷，并用Transwe11系統(tǒng)將其與bmMSC共培養(yǎng)，檢測離體胰島的活性及GSIS胰島素分泌，MS-1的活性、凋亡及eNOS活性等功能學指標。
　　2、qPCR比較大鼠離體胰島及胰島微循環(huán)內皮細胞MS-1與bmMSC的Wnt蛋白表達差異，并觀察bmMSC輸注后或Transwell培養(yǎng)后胰島及MS-1中β-catenin依賴性的Wnt通路的激活情況。
　　3、使用XAV-939

14、特異性阻斷胰島或MS-1中的β-catenin，觀察bmMSC共培養(yǎng)對H202誘導的氧化應激損傷的挽救作用是否被抵消。
　　4、對bmMSC中的Wnt4、Wnt5a分別進行敲除，并將敲除后的bmMSC與胰島和MS-1分別共培養(yǎng)，觀察Wnt4和Wnt5a敲除對胰島和MS-1氧化應激的活性變化、凋亡及胰島素分泌量、eNOS活性等功能學指標的改變。
　　5、將分別敲除Wnt4、Wnt5a后的bmMSC與MS-1分別培養(yǎng)，觀察MS-

15、1中的β-catenin依賴性的Wnt通路的激活情況。
　　研究結果
　　第一部分不同種類干細胞靜脈輸注對2型糖尿病大鼠治療效果的比較
　　1、T2DM造模成功后SD大鼠血糖明顯升高，但干細胞輸注后空腹血糖較前明顯下降，該治療效果可維持至輸注后8w。不同干細胞及不同輸注次數(shù)的組間，空腹血糖水平無明顯差異。IPGTT結果顯示干細胞輸注后2w大鼠的餐后血糖并無明顯改善;然而至4w時各組各時點的血糖均較T2DM有明顯下降。8

16、w時，雖然空腹及餐后0.5h干細胞干預組仍可保持較好血糖控制，然而除了hucMSC+CBSC雙次注射組外，其余各組的1-3h血糖均與T2DM組無明顯差別。
　　2、干細胞輸注可顯著抑制T2DM大鼠升高的空腹胰高糖素，各組間效果無明顯差異。bmMSC或CBSC單獨輸注均可顯著改善T2DM大鼠的空腹胰島素水平，其他各組對此指標的改善不明顯。胰島素釋放試驗結果顯示，干細胞輸注2w時，bmMSC輸注組的餐后胰島素水平有明顯升高，其他組無明

17、顯改變，但各組釋放曲線形態(tài)均較紊亂;至4w時，各組胰島素釋放曲線明顯規(guī)整，基本均可于餐后3h回落至基線水平，其中bmMSC或CBSC單獨輸注的餐后胰島素水平均明顯高于T2DM未處理組;8w時，bmMSC輸注組的釋放曲線進一步趨近正常，而hucMSC+CBSC雙次注射組表現(xiàn)出明顯的餐后胰島素釋放增多。除bmMSC組外，其他各組均可顯著抑制餐后胰高糖素的分泌。
　　3、干細胞輸注后2w及4w，干細胞可顯著保存胰島面積;在保存β細胞面積

18、方面，bmMSC的效果較明顯。對于改善胰島內α、β細胞比例方面，干細胞輸注后2w各組均未見明顯改善;4w時，bmMSC表現(xiàn)出較為明顯的β細胞比例增加，而所有干細胞輸注組的α細胞面積均顯著減少，各組間無明顯差異;8w時，所有干細胞輸注組的α細胞面積均顯著減少的趨勢持續(xù)，而CBSC單次注射及hucMSC+CBSC、hucMSC*2次三組均表現(xiàn)為β細胞比例明顯增加:提示CBSC單次注射或干細胞2次注射可將改善β細胞比例的治療維持更久。

19、　　4、在干細胞輸注2w及4w時均可于CBSC單次輸注、hucMSC+CBSC及hucMSC*2次輸注組中觀察到PCNA陽性的β細胞明顯增多，提示β細胞增生。而觀察至8w，增生的情況明顯降低，唯有hucMSC+CBSC仍可觀察到明顯的增生。
　　5、本研究還觀察到CBSC組部分胰島細胞出現(xiàn)胰島素與胰高糖素共染的情況，但該現(xiàn)象并未在其他組中出現(xiàn)，提示CBSC可能促進了α向β細胞的轉化。
　　6、經過胰島素敏感性指數(shù)及肝臟胰島素

20、通路相關蛋白表達的雙重印證，bmMSC單次輸注、hucMSC單次輸注及hucMSC先后兩次輸注可顯著改善T2DM大鼠的胰島素抵抗狀態(tài)。
　　7、空腹的T2DM大鼠肝臟中存在糖原合成減少、糖酵解受抑、糖異生增加及胰島素抵抗;而干細胞的輸注可選擇性地作用于其中不同的關鍵酶，發(fā)揮調節(jié)作用:在改善肝糖原合成方面，本文涉及的所有干細胞輸注方案均有效果;改善葡萄糖轉運方面，bmMSC與hucMSC單次輸注效果明顯;bmMSC與hucMSC單次

21、輸注亦可促進糖酵解、抑制糖異生并改善空腹肝臟胰島素抵抗。輸注多次干細胞的兩組對肝臟的作用則更多體現(xiàn)在抑制糖異生及改善胰島素抵抗方面。
　　8、除CBSC單次輸注組可觀察到明顯TC、TG下降外，其他各組對血脂指標的改善不明顯。
　　9、hucMSC+CBSC及hucMSC*2次輸注可明顯改善各項炎癥相關免疫指標，如IL-1b、IL-6、IL-17、IL-22及IFN-g。
　　第二部分 MSC改善胰島及胰島微循環(huán)內皮細胞

22、功能的機制研究
　　1、bmMSC與MS-1細胞共培養(yǎng)可顯著改善H202所致的凋亡、eNOS活性降低及VCAM升高;同時也可改善氧化應激損傷后離體胰島的活性下降及高糖刺激下的胰島素分泌障礙。
　　2、bmMSC較離體胰島和MS-1細胞可表達顯著增高的Wnt4和Wnt5a。bmMSC靜脈輸注的T2DM大鼠胰島中存在β細胞和內皮細胞的β-catenin核轉位，同時與MSC共培養(yǎng)后的MS-1也存在β-catenin核轉位增加，提示

23、MSC可激活β細胞及內皮細胞中的經典Wnt通路。
　　3、用XAV-939處理胰島及MS-1后，bmMSC的上述改善作用顯著降低，提示干細胞的有益作用可能由激活經典Wnt通路介導。
　　4、在MSC中分別沉默Wnt4、Wnt5a后再與H202刺激的MS-1/離體胰島共培養(yǎng)，結果顯示W(wǎng)nt4沉默可顯著降低MSC對上兩者的改善作用:說明MSC分泌的Wnt4可能是介導其對氧化應激胰島及內皮細胞挽救作用的關鍵因子之一。
　　5

24、、在MSC中沉默Wnt4后MS-1細胞中經典Wnt通路激活減弱，提示MSC分泌的Wnt4可通過激活經典Wnt通路，改善胰島微循環(huán)內皮細胞的存活及功能。
　　研究結論
　　在我們的研究中，首次對比了骨髓、臍帶來源的間充質干細胞及臍血干細胞，輸注一次或兩次對T2DM大鼠模型胰島功能和糖代謝的改善效果，首次觀察了干細胞輸注對胰島α細胞功能和比例的影響，并觀察了干細胞對IL-22的作用。
　　1、所有干細胞在降低T2DM空腹血

25、糖方面效力等同，但在平穩(wěn)餐后血糖方面唯有hucMSC+CBSC的治療組可將有效性持續(xù)至輸注后8w。
　　2、bmMSC和CBSC組改善空腹胰島素作用明顯，bmMSC和hucMSC+CBSC先后注射組改善糖負荷后胰島素分泌的作用可持續(xù)至8w。
　　3、CBSC單次注射或干細胞2次注射（T2DM+hucMSC&CBSC組及T2DM+hucMSC*2組）可將改善β細胞比例的治療維持更久，可能與維持持續(xù)性的β細胞增生有關。
　

26、　4、各種干細胞輸注均可明顯抑制胰高糖素空腹及餐后的分泌，并抑制α細胞的增生。
　　5、bmMSC單次輸注、hucMSC單次輸注及hucMSC先后兩次輸注均可顯著改善胰島素抵抗狀態(tài)。
　　6、本文涉及的所有干細胞輸注方案均可改善肝糖原合成;bmMSC與hucMSC單次輸注可顯著改善肝臟葡萄糖轉運，亦可促進糖酵解、抑制糖異生;hucMSC雙次輸注可促進糖酵解、抑制糖異生。
　　7、CBSC單次輸注可明顯降低TC、TG。<