c-Cb1介導的對P-選凝素誘導β2整合素活化的負反饋調控機制的研究和SHKBP1抑制表皮生長因子受體（EGFR）信號負調控機理的研究.pdf

1、c-Cbl是一個"Ring Finger"類型的E3泛素化激酶,它能夠與酪氨酸激酶和受體酪氨酸激酶結合并被磷酸化,磷酸化后的c-Cbl泛素化激酶活性被激活,使與其結合的酪氨酸激酶和受體酪氨酸激酶多聚泛素化降解。其中Src家族酪氨酸激酶的很多成員(Lyn,Fgr,Yes等)已被報道與c-Cbl結合并受它的泛素化降解調控。P-選凝素配體PSGL-1(P-sclcctin glycoprotein ligand-1,CD162)已被發(fā)現(xiàn)直接參

2、與白細胞中P-選凝素介導的整合素活化過程,我們實驗室以前的研究具體闡明了一條P-選凝素結合PSGL-1誘導活化整合素的信號通路,發(fā)現(xiàn)了與PSGL-1組成性結合的蛋白Naf1,以及Src和P13K在通路中發(fā)揮關鍵作用。在這里,我們的進一步研究表明,c-Cb1泛素化激酶也參與到PSGL-1誘導活化整合素的信號通路中,并且通過調控活化的Src水平起到負反饋調控的作用,避免信號的過度持續(xù)活化。 當P-選凝素和其配體PSGL-1結合時,

3、可以通過激活Src激酶來磷酸化Naf1,然后富集PI3K的P85/P110亞基向下傳遞信號最終促使β2整合素活化,進而介導中性粒白細胞的粘附；活化的Src同時與c-Cb1結合,并磷酸化c-Cb1第700,731和774位酪氨酸殘基來激活它的泛素化激酶活性,最后使活化的Src多聚泛素化和依賴蛋白酶體的降解。活化的Src水平因泛素化降解而下調后,其下游的Naf1和PI3K的活性也緊跟著被下調,使β2整合素活性降低,導致細胞粘附能力下降。進一

4、步的研究發(fā)現(xiàn),P-選凝素和PSGL-1的結合還促進了Src,c-Cb1和Naf1向Lipid raft小體的富集,以有利于向下游級聯(lián)傳遞信號。而且抑制c-Cb1的表達或者過表達c-Cb1泛素化激酶活性缺失的突變體(第371位酪氨酸殘基定點突變成苯丙氨酸)都能抑制c-Cbl的活性從而增加細胞的粘附能力?？傊?我們的研究發(fā)現(xiàn)的c-Cbl介導的負反饋調控機制對P-選凝素結合PSGL-1誘導活化整合素的信號通路進行了很好的補充,更完善的闡明了有

5、機體對炎癥過程的精細調控,避免了信號的過度持續(xù)活化。對更加深入了解炎癥反應的分子機理提供了有利幫助。在表皮生長因子(EGF)刺激時,表皮生長因子受體(EGFR)與其結合并發(fā)生二聚化,然后發(fā)生自身磷酸化的EGFR與c-Cbl通過其SH2保守結構域結合并使之磷酸化,被磷酸化的c-Cbl激活了泛素化激酶活性,泛素化EGFR的同時,富集胞漿中的CIN85和Endophilin復合物,并與Dynamin和Clathrin等一起使細胞表面向內凹陷脫

6、落形成胞內小體,然后通過多種囊泡小體分選,一部分重新循環(huán)到細胞表明再次參與到信號傳遞中,其余的都通過溶酶體降解。研究發(fā)現(xiàn),當EGFR中的磷酸化位點或泛素結合位點發(fā)生突變時,細胞內表皮生長因子受體的表達就會上調,從而造成組織的癌變。因此對EGFR活化后負調控的研究和闡明具體的抑制此負調控的機理十分重要。 CIN85首先作為85kD大小的Cbl結合蛋白被發(fā)現(xiàn),它的N端由3個SH3保守結構域組成,中間是一段富含脯氨酸的區(qū)域,C端是一

7、段α螺旋狀的卷曲螺旋。它的SH3結構域和富含脯氨酸的區(qū)域使它成為一個配體蛋白,參與很多蛋白間的結合傳遞信號,C端的卷曲螺旋和它的細胞定位和自身多聚化有關。近年來,CIN85參與負調控表皮生長因子受體信號的研究逐漸深入。 我們通過酵母雙雜交的方法篩選到一個SHKBP1基因,通過命名原則序列分析我們發(fā)現(xiàn)SHKBP1上存在兩個富含脯氨酸的區(qū)段(PXXXPR)可以參與和CIN85的結合,免疫共沉淀實驗和以SHKBP1作為“誘餌”進行酵

8、母雙雜交篩選都證實了SHKBP1和CIN85的結合,進一步的實驗發(fā)現(xiàn)兩者的結合可以競爭抑制c-Cbl和CIN85的結合,從而影響c-Cbl和CIN85復合物介導的EGFR信號活化后的負調控。我們發(fā)現(xiàn)SHKBP1可以抑制EGFR活化后的降解,并能上調EGFR活化后的下游轉錄因子的轉錄水平。我們的研究發(fā)現(xiàn)了一個可能的抑制EGFR信號活化后負調控的機制,為進一步的研究深入提供了一定的基礎。PDCD2L(PDCD2 like)因為其和PDCD2

9、一樣在C端都含有一個PDCD2_C保守結構域而得名,所以也被認為可能具有凋亡調節(jié)活性。但是我們前面的研究發(fā)現(xiàn)它在凋亡過程中對STAT蛋白沒有影響,而且其本身的水平也基本沒有變化,過表達PDCD2L后細胞的凋亡也沒有增加,同時我們發(fā)現(xiàn)PDCD2L和PDCD2在炎癥過程中具有一定的作用,過表達PDCD2L和PDCD2的細胞在LPS刺激下能抑制TNF-α的釋放。所以我們通過Pull-down實驗來篩選可能和PDCD2L結合的蛋白,以便能更好的

10、研究PDCD2L的功能。我們共篩選到12種與PDCD2L有相互作用的蛋白,其中的兩個為LDHA和LDHB。 LDH有五種同工酶組成,它是一個四聚體,有LDHA和LDHB兩個單體相互組合形成。LDHA和LDHB在哺乳動物的發(fā)育過程中表達并具有組織特異性,所以血清中的LDH水平和不同同工酶的分布可以作為炎癥、腫瘤等病理進程的指示劑。我們通過免疫共沉淀實驗證實了PDCD2L和LDHA/B的結合,并且也確認了并不是PDCD2L的PDCD2_C結