超嗜熱古菌Sulfolobus tokodaii PCNA復合體的生化性質暨Hjm與Hjc相互作用的初步鑒定.pdf

1、生存在自然環(huán)境中的所有生物都會不可避免地面臨各種不利于其生長的危險，例如來自于生活環(huán)境中的各種有害化學物質以及生物自身體內的有害代謝產物等等，這些因素都會對生物的基因組DNA造成損傷，而生物體內擁有完整的一套DNA修復系統(tǒng)，維持其基因組穩(wěn)定。值得注意的是超嗜熱古菌比起一般生物生活環(huán)境更加惡劣，但是仍然能活躍生存在那種極端環(huán)境中，其體內必定含有更優(yōu)越的DNA損傷修復機制。此外，由于古菌DNA代謝中的各種因子與細菌相比更相似于真核生物，所以

2、探索古菌DNA代謝奧秘，無疑也會為復雜的真核生物研究提供可靠的幫助。 滑動夾(sliding clamp)參與DNA復制，修復以及細胞周期調控等多種DNA代謝途徑，是各種生物維持生存必要的蛋白因子，可以作為一種平臺與DNA代謝中的多種蛋白因子相互作用，例如DNA復制聚合酶，連接酶等。細菌中的滑動夾為DNA復制聚合酶的一個亞基稱β-夾子(β-clamp)，真核生物和古菌中稱這-蛋白為PCNA(proliferating cell

3、nuclear antigen)。不同生物的滑動夾雖然在序列上并不是保守的，但是結構上都是一種相似的環(huán)狀復合物，中間具有-DNA通過的孔道，預示著它們發(fā)揮功能作用的方式可能是相似的。例如，幾種滑動夾都需要一種輔助蛋白的參與作用，即滑動夾裝載蛋白(clamp loader)，細菌中為γ-復合物，而真核生物和細菌中為RFC(replication factor C，RFC)。然而，滑動夾復合物在三種生物域中也具有多樣性，例如，他們寡聚狀態(tài)也

4、并不保守，細菌中的β-夾子為同源二聚體，真核生物及廣古菌中PCNA為同源三聚體，而泉古菌中為異源三聚體。由于在古菌DNA修復系統(tǒng)中，PCNA是不可缺少的因子，因此，研究古菌的這一蛋白對于了解其特有的DNA修復機制十分有意義。 本文主要介紹了對超嗜熱古菌Sulfolobus tokodaii三個PCNA亞基間的相互作用和一些生化性質的初步研究。主要利用基因重組技術獲得了來自S．tokodaii三個PCNA亞基的重組蛋白，首先利用H

5、is-pull down，酵母雙雜交以及分子篩層析等蛋白互作方法，檢測到體內，體外PCNA單亞基均不能形成同源聚體，PCNA1和PCNA3可形成二聚體，PCNA1，PCNA2和PCNA3形成三聚體。很有意思的是我們發(fā)現(xiàn)PCNA2和PCNA3也可形成三聚體，其中的成分有兩種可能，即PCNA223和PCNA323。接下來我們設計實驗驗證其成分，主要是利用His-pull down方法，鑒定出了一種新的PCNA三聚體，其成分為PCNA323。

6、然后結合Pull down和分子篩層析兩種方法將PCNAl23和PCNA323兩種三聚復合體分別純化出來，并分別檢測它們對參與DNA修復的幾個蛋白因子活性的影響。發(fā)現(xiàn)兩種復合體均以相同程度抑制解旋酶StotHim以及連接酶StoLigase活性，PCNA323較強于PCNAl23刺激核酸內切酶StoHjc的活性。本實驗所獲得的實驗數(shù)據(jù)與其他報道相比較分析，發(fā)現(xiàn)古菌中的PCNA亞基間相互作用關系具有一定的多樣性，即使是同屬泉古菌的S．so

7、lfataricus或Aeropyrumpernix中的同源PCNA都存在著差別。關于本文中鑒定出的PCNA兩種三聚體復合體的具體功能，以及相互之間差異還需要進一步的實驗分析。 另外，有文章報道在S．solfataricus中PCNA可以與重組修復過程中的核酸酶Hjc(Holliday junction cleavage)具有相互作用，Prococcus．furiosus中PCNA與Hjm具有相互作用。同時，我們發(fā)現(xiàn)S．toko

8、daii中StoHjc可以與同樣參與重組修復途徑的StoHjm解旋酶(Holliday junction migration)具有相互作用，根據(jù)以上信息，我們推測PCNA，StoHjc和StoHjm可能會形成一種三聚體行使某種生理功能，于是著手實驗驗證這種猜測。在本論文的后一部分，我們介紹了有關StoHjm和StoHic的工作，通過分子篩層析，His-pull down和酵母雙雜交證明了StoHjm可以與StoHjc之間存在相互作用，并

9、且StoHjc抑制StoHjm的解旋酶活性。目前，雖然沒有檢測到StoHjm和核酸內切切酶StoHjc與PCNA之間具有相互作用，但是我們會優(yōu)化實驗條件繼續(xù)研究。另外，為了了解StoHjm與StoHjc相互作用的分子機制，我們計劃利用缺失突變方法進一步探索。 本文初步研究了S．tokodaii中PCNA，以及Hjm和Hjc這幾個蛋白的生化性質及其相互之間的關系，為深入了解S．tokodaii的修復機制提供了依據(jù)，并為進一步研究奠