2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、極端嗜熱古菌硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus P2)含有三個有活性的復制原點和三個真核類似的Orc1/Cdc6蛋白(命名為SsoCdc6-1, SsoCdc6-2和SsoCdc6-3),因此成為研究真核生物復雜DNA復制機制的理想材料。但是目前還不清楚古菌的這種多個Orc1/Cdc6蛋白之間能否通過功能性的相互作用共同來調(diào)控DNA復制起始。本研究采用純化的復制起始蛋白SsoCdc6及其突變體,在體外比較研究

2、了它們與兩個復制原點DNA之間的相互作用,特別是首次對古菌的多個SsoCdc6蛋白相互調(diào)控它們與原點DNA的相互作用進行了系統(tǒng)的生化分析。本研究主要取得了以下幾個方面的結(jié)果:
   1.構(gòu)建了SsoCdc6-2蛋白和SsoCdc6-2的C-末端缺失體(SsoCdc6-2△C)的大腸桿菌表達菌株,并通過熱處理和Ni-NTA鎳瓊脂糖凝膠親和純化等步驟獲得純度達99%以上的SsoCdc6蛋白和SsoCdc6△C蛋白;針對S.solfa

3、taricus復制原點oriC1和oriC2的結(jié)構(gòu)特征,設(shè)計了分別包括分叉和平端兩種結(jié)構(gòu)的三組特異性DNA底物。這些底物的共同特征是含有相互重疊的SsoCdc6結(jié)合位點。
   2.通過一系列電泳遷移率改變實驗(EMSA),發(fā)現(xiàn)SsoCdc6-1能夠刺激SsoCdc6-2和SsoCdc6-3的DNA結(jié)合活性;相反,SsoCdc6-3抑制SsoCdc6-1與DNA底物的結(jié)合。而且它們的C-末端缺失體(SsoCdc6△C)基本保留了

4、這種類似的調(diào)控功能。因此,三個SsoCdc6蛋白能夠相互調(diào)控(正調(diào)控或者負調(diào)控)各自對原點特異性DNA的結(jié)合。
   3.采用Pull-down/Western blot分析,發(fā)現(xiàn)了如下幾組蛋白間物理性的相互作用:SsoCdc6-1/SsoCdc6-3,SsoCdc6-1△C/SsoCdc6-3,SsoCdc6-1/SsoCdc6-2,SsoCdc6-1△C/SsoCdc6-2,SsoCdc6-2/SsoCdc6-3,SsoCd

5、c6-2/SsoCdc6-3△C。另外,采用細菌雙雜交技術(shù),檢測到了三個SsoCdc6蛋白與另一個復制起始蛋白SsoMCM均能發(fā)生物理的相互作用。
   4.構(gòu)建了SsoCdc6-2蛋白WalkerA模體的定點突變體(SsoCdc6-2KA)的大腸桿菌表達菌株,通過優(yōu)化表達條件獲得了重組蛋白。進一步的EMSA實驗表明,SsoCdc6-2KA保留了結(jié)合DNA的特性但失去了自磷酸化的功能。
   DNA復制過程是個十分復雜的

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