MBD2基因敲除緩解高脂飲食誘導小鼠肥胖的機制研究.pdf

1、背景和目的：隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展以及人民生活水平的提高，肥胖癥開始遍及全球。中國肥胖人群數(shù)量僅次于美國，位居第二位。作為曾經(jīng)的“瘦人大國”，中國在很短的時間內(nèi)，變成了“肥胖大國”。肥胖與糖尿病、高血壓、冠心病等慢性非傳染性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是其重要的危險因素之一。
　　肥胖癥是一個多因素的疾病，與遺傳、飲食、生活習慣、環(huán)境等因素息息相關(guān)。近年來關(guān)于肥胖及2型糖尿病的遺傳學研究取得了較大的進展，大量的GWAS研究篩選出約40個與

2、遺傳易感性相關(guān)的靶基因，然而這些易感基因只能解釋20％病人的發(fā)病。而作為肥胖病發(fā)生的一個重要的因素，即環(huán)境因素如何對肥胖起作用，目前越來越受到重視。最新研究表明，表觀遺傳在基因表達調(diào)節(jié)、細胞分化以及疾病中起著中心的作用。表觀遺傳學包括DNA甲基化、組蛋白修飾和小分子RNA（MicroRNA和SiRNA等）。DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾，它調(diào)控DNA的轉(zhuǎn)錄但不改變其核苷酸序列，被認為是連接環(huán)境因素與遺傳物質(zhì)之間的重要橋梁。飲食、生活方式

3、、社會或家庭壓力、慢性炎癥、細菌感染、射線及毒物等諸多環(huán)境因素均可誘導DNA甲基化水平或模式的改變，故DNA甲基化可記錄不同個體一生中對各種環(huán)境誘因的暴露，編碼基因組以外的信息，參與調(diào)控個體對疾病的易感性如對肥胖病的易感性。
　　DNA甲基化的表觀遺傳信息是由甲基化CpG結(jié)合蛋白解讀的。甲基化CpG結(jié)合蛋白家族包括MeCP2、MBD1、MBD2、MBD3和 MBD4，它們以細胞和基因特異性方式結(jié)合到甲基化的CpG DNA上，其中M

4、BD2與甲基化CpG DNA的親和力最高。一旦它們與靶基因調(diào)控區(qū)域甲基化CpG DNA結(jié)合，即招摹染色質(zhì)重塑或是修飾因子，改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，干擾轉(zhuǎn)錄因子與靶標基因的結(jié)合，進而抑制基因的轉(zhuǎn)錄。因此，MBD2蛋白是研究表觀遺傳學良好的靶點。
　　胎兒期宮內(nèi)環(huán)境通過改變DNA甲基化參與到成年后肥胖的發(fā)病過程已被研究者們所公認。高脂飲食通過改變DNA甲基化，實現(xiàn)代間傳遞，影響到后代的脂肪、肝臟的功能從而促進糖代謝異常以及2型糖尿病的發(fā)生。

5、食物中，甲基供體直接影響肝臟 DNA甲基化水平，參與到非酒精性脂肪肝的發(fā)生。這些都為我們研究DNA甲基化與肥胖提供了重要線索。
　　GWAS研究揭示MBD2與2型糖尿病的易感性相關(guān)，且介導的遺傳易感性為普通人群的1.45倍；后續(xù)GWAS研究進一步揭示 MBD2是肥胖癥的易感基因，故在GWAS的數(shù)據(jù)庫中，MBD2被列入與肥胖關(guān)聯(lián)的易感基因。我們實驗室在繁殖飼養(yǎng)Mbd2敲除小鼠過程中，發(fā)現(xiàn)Mbd2敲除小鼠體重偏輕。結(jié)合已有的文獻報道，

6、我們設(shè)想：DNA甲基化參與到肥胖的發(fā)生，高脂飲食誘導小鼠脂肪組織基因組DNA發(fā)生甲基化改變，該甲基化的信息由MBD2蛋白解讀，Mbd2基因敲除后甲基化變化的信息不被解讀，從而保護高脂飲食誘導的肥胖。因此，我們給予Mbd2野生型以及敲除型小鼠高脂飲食喂養(yǎng)，誘導肥胖模型，觀察Mbd2在高脂飲食誘導小鼠肥胖中的作用。同時我們采用MBD2 Chip-seq的技術(shù)，進行高通量測序，觀察高脂飲食誘導DNA甲基化的模式改變，并篩選Mbd2調(diào)控的靶基因

7、。通過本項目研究不僅從新的視角闡述肥胖癥發(fā)生的病理機制，而且為臨床預防、治療肥胖癥提供新的思路以及線索，對于探索新的代謝性疾病的防治策略具有重要意義。
　　方法與結(jié)果：我們用高脂飲食誘導小鼠肥胖模型，誘導16周，研究MBD2在肥胖病發(fā)病中的作用，觀察MBD2在高脂飲食誘導肥胖的糖代謝、脂代謝以及能量代謝中的作用。同時，將Mbd2敲除小鼠和ob/ob小鼠雜交，得到Mbd2（-/-）ob/ob雙敲除小鼠，觀察Mbd2在肥胖模式動物中的

8、作用。結(jié)果示：高脂飲食連續(xù)喂養(yǎng)4周時，給予高脂飲食喂養(yǎng)野生型小鼠體重高于普通飲食喂養(yǎng)小鼠的體重，提示高脂飲食誘導成功，當喂養(yǎng)到8周時，Mbd2野生型小鼠體重即比敲除小鼠體重高。繼續(xù)喂養(yǎng)，當喂養(yǎng)總時間為16周時，體重差異明顯。高脂飲食誘導肥胖小鼠Mbd2敲除小鼠附睪脂肪組織重量明顯小于野生型小鼠脂肪組織重量。為了排除Mbd2基因敲除影響小鼠生長發(fā)育的原因，處死小鼠時，我們測量了小鼠脛骨的長度，Mbd2敲除小鼠和野生型小鼠脛骨長度沒有統(tǒng)計學

9、差別，提示Mbd2敲除沒有對小鼠的生長發(fā)育產(chǎn)生影響。在小鼠開始實驗的第一個月（第8-12周），連續(xù)記錄小鼠的攝食。結(jié)果顯示，Mbd2敲除小鼠攝食量大于野生型小鼠。高脂飲食誘導16周時，空腹狀態(tài)下普通飲食小鼠，WT組小鼠與KO組小鼠血糖值兩組之間有一定的差別，但無統(tǒng)計學差異。經(jīng)高脂飲食誘導16周時，野生型小鼠空腹血糖與Mbd2敲除小鼠血糖值相比有明顯統(tǒng)計學差異。我們也檢測了進食狀態(tài)下的血糖值，得到了一致的結(jié)果。同時，我們也用ELISA的方

10、法檢測了空腹狀態(tài)下的胰島素的水平。高脂飲食喂養(yǎng)情況下，野生型小鼠空腹胰島素濃度是敲除小鼠胰島素濃度的1.95倍。為了更進一步反應(yīng)機體的糖代謝異常，我們采用了通用的胰島素穩(wěn)態(tài)模型（HOMA-IR）來反應(yīng)胰島素抵抗的情況。普通飲食情況下，野生型小鼠和Mbd2敲除小鼠HOMA-IR值無統(tǒng)計學差異；高脂飲食情況下，野生型HOMA-IR值為敲除組的2.67倍。接著我們給小鼠予以葡萄糖耐量實驗以及胰島素敏感實驗，實驗結(jié)果顯示兩項指標均有明顯統(tǒng)計學差

11、異。此外，我們用Western Blot檢測附睪脂肪中胰島素相關(guān)的信號通路蛋白。檢測p-IRS Y989/IRS以及P-AktThr308/Akt的表達水平，結(jié)果顯示高脂飲食誘導情況下，脂肪組織中p-IRS以及p-Akt的表達量均明顯下降，Mbd2敲除小鼠p-IRS以及p-Akt表達量高于野生型小鼠。此結(jié)果從分子水平反應(yīng)Mbd2敲除小鼠脂肪組織胰島素抵抗輕于野生型小鼠。同時，我們將Mbd2小鼠和ob/ob小鼠雜交，得到Mbd2（-/-）

12、ob/ob雙敲除的小鼠，初步觀察到雙敲除的小鼠體重低于ob/ob小鼠，脂肪細胞面積小于ob/ob小鼠，以及肝臟脂肪沉積少于ob/ob小鼠。綜合以上結(jié)果說明，Mbd2敲除能夠改善高脂飲食誘導肥胖小鼠的葡萄糖耐量異常以及胰島素抵抗。
　　為了研究DNA甲基化在肥胖發(fā)生中的作用機制，我們首先從整體水平觀察DNA甲基化在肥胖發(fā)生中的變化。我們?nèi)「讲G脂肪組織，提取基因組DNA，用ELISA的方法檢測基因組 DNA總甲基化的情況，高脂飲食誘導

13、肥胖時DNA甲基化的比率下降了約40%。而在普通飲食情況下，Mbd2野生型以及敲除型小鼠附睪脂肪組織DNA甲基化沒有明顯變化。此結(jié)果說明，給予高脂飲食誘導肥胖時，附睪脂肪組織基因組DNA發(fā)生低甲基化，而且在普通飲食情況下Mbd2敲除小鼠以及野生型小鼠附睪脂肪組織甲基化沒有明顯區(qū)別。同時為了解在肥胖病人是否也出現(xiàn)這一現(xiàn)象。我們收集了肥胖病人以及正常人大網(wǎng)膜組織樣本，檢測其DNA甲基化比率，發(fā)現(xiàn)肥胖患者DNA甲基化低于正常人基因組DNA甲基

14、化情況，該結(jié)果和小鼠中的結(jié)果一致，更進一步驗證了該現(xiàn)象。接著我們檢測 MBD2蛋白在肥胖相關(guān)的靶器官中的表達情況，在高脂飲食誘導的肥胖小鼠中，附睪脂肪、肝臟、骨骼肌中MBD2蛋白表達都降低，該趨勢同DNA甲基化程度趨勢一致。為了尋找MBD2結(jié)合的靶標基因，以及分析全基因組DNA甲基化變化的模式，我們采用了MBD2 Chip-seq的方法。我們先進行MBD2染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)，得到與MBD2結(jié)合的DNA，然后將DNA樣品交由華大基因公司

15、進行高通量測序。檢測及分析結(jié)果提示，經(jīng)高脂飲食誘導后，出現(xiàn)了甲基化的變化，其中以高脂飲食中特異性的基因增多為特點。同時也對相同的peaks區(qū)域的富集度做了分析。結(jié)果顯示高脂飲食誘導肥胖小鼠和普通飲食小鼠附睪脂肪組織DNA甲基化模式存在差異。結(jié)合前面的表型以及初步結(jié)果，我們提出假設(shè)：生理情況下，機體中能量儲存與能量消耗相平衡，當高脂飲食刺激時，機體全基因組發(fā)生DNA低甲基化改變，其中DNA低甲基化改變對能量儲存的基因影響大，促使機體儲存更

16、多的能量，進而造成肥胖的發(fā)生。當MBD2缺失時，該甲基化變化信息不被解讀，進而保護高脂飲食誘導的肥胖的發(fā)生。為了證明我們的假設(shè)，我們從中挑選了一些抑制肥胖發(fā)生以及促進肥胖發(fā)生的基因進行甲基化分析。抑制肥胖發(fā)生的基因Ucp1，Leptin轉(zhuǎn)錄起始位點上游peaks區(qū)域發(fā)生DNA低甲基化改變。促進肥胖發(fā)生的基因，Hif1-α以及Raptor也發(fā)生DNA低甲基化改變。同時，我們對這些區(qū)域做了生物信息學分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在這些區(qū)域均有相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因

17、子結(jié)合位點。我們對這些基因做了mRNA水平以及蛋白水平的表達分析，發(fā)現(xiàn)當DNA出現(xiàn)低甲基化改變時，相應(yīng)的mRNA水平和（或）蛋白水平升高。
　　結(jié)論：本研究初步揭示了DNA甲基化與肥胖的關(guān)系。我們首先發(fā)現(xiàn)Mbd2敲除顯著緩解高脂飲食誘導的小鼠肥胖的發(fā)生，以及能夠顯著緩解高脂飲食誘導的小鼠糖代謝異常，脂代謝異常以及脂肪肝的發(fā)生，Mbd2敲除可能通過增加能量代謝減緩肥胖的發(fā)生。Mbd2敲除可以緩解ob/ob小鼠的肥胖的發(fā)生以及脂肪肝的