宏基因組研究高脂飲食誘導小鼠的肥胖易感性與腸道菌群的關系.pdf

1、肥胖癥是一種營養(yǎng)障礙性疾病，典型特征為超重，脂肪過多，原因主要是能量代謝失調(diào)，出不敷入。與單純性肥胖不同，過度肥胖會成為多種代謝疾病的誘因，比如糖尿病、心血管疾病、慢性腎病等。其在2003年被世界衛(wèi)生組織定義為全球性流行病，患病率在未來十年估計會增長40％，已成為危害人類健康的主要疾病之一。而現(xiàn)代肥胖發(fā)生的諸多誘因中不規(guī)律飲食及飲食結構不合理，機體攝入過多熱量成為主要因素。長期的高熱量飲食（高脂肪、高蛋白、高糖）會誘導肥胖的發(fā)生，引起人

2、體代謝紊亂，促進各種并發(fā)癥，危害極大。在現(xiàn)實生活中，人們發(fā)現(xiàn):同樣攝入高脂飲食的人，有的人就是“吃不胖”，有的人攝入量很有限，但仍然容易長胖，自稱“喝水也胖”?？梢姡逝钟袀€體代謝與遺傳學差異。對于高脂飲食誘導的群體除了人類以外，小鼠作為科學研究中普遍運用的實驗動物屢屢被用到。早在20世紀80年代初期，Levin等用高脂飲食飼喂同一批次Sprague-Dawley大鼠后發(fā)現(xiàn)，一部分大鼠會發(fā)生肥胖，稱為飲食誘導的肥胖(diet-induc

3、ed obesity,DIO)，而另一部分大鼠并未發(fā)生肥胖，稱為飲食誘導的肥胖抵抗(diet-induced obesity resistance，DIOR)。由此可見，同種動物不同個體對于高脂飲食誘導的肥胖易感性存在差異。近年的研究表明，高脂飲食會影響人體腸道菌群的組成結構和功能，而腸道菌群被稱為人體的“第二基因組”，能參與調(diào)節(jié)多種代謝途徑，維持腸道微生態(tài)平衡，其中脂代謝、碳水化合物代謝等與肥胖的發(fā)生有著密切的關系，而人們對腸道菌群與

4、個體肥胖易感性的關系遠沒有那么清晰的認識。得益于宏基因組學的發(fā)展，對于腸道菌群的結構功能有了進一步了解，借助于生物信息學分析工具，能讓深入了解腸道菌群與高脂飲食誘導的不同個體肥胖易感性的關系，有助于深入探索腸道菌群在肥胖發(fā)生中扮演的角色。本研究利用高脂飲食誘導C57BL/6J小鼠用以建立肥胖和肥胖抵抗模型，通過宏基因組學分析比較不同模型小鼠腸道菌群在結構組成與功能上的差異，探討腸道菌群與肥胖及肥胖抵抗之間的聯(lián)系。以下為主要研究內(nèi)容及結果

5、:
　　1.高脂飲食小鼠模型的構建及判定:取30只C57BL/6J小鼠，10只作為對照，飼喂普通飼料，20只作為模型組，飼喂高脂飼料。造模期結束后，超過對照組小鼠體重平均增長率的2倍的小鼠劃定為“高脂飲食誘導肥胖組”(HFDIO組)，共8只，其余未達到肥胖標準的稱為“高脂飲食誘導肥胖抵抗組”(HFDIOR組)，共12只。
　　2.小鼠糞便的收集與基因組DNA提取，宏基因組測序:采用腹部按摩法在造模期結束后取小鼠新鮮糞便，按照

6、QIAamp(@)Fast DNA Stool Mini kit說明書（購自德國QIAGEN公司）提取糞便中的DNA，檢測濃度、純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組完整性后，基因組樣品置于干冰中，委托深圳華大基因科技服務有限公司測序。質(zhì)檢后選擇未降解的18個樣品(Control6只，HFDIO7只，HFDIOR5只)進行宏基因組文庫構建與測序，并進行數(shù)據(jù)質(zhì)控、過濾、組裝和基因集構建。
　　3.高脂飲食誘導的小鼠腸道菌群物種注釋與物種豐度

7、分析:所得基因集與NCBI非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫nr進行比對。經(jīng)過物種注釋及豐度分析發(fā)現(xiàn)，相比Control組，HFDIO組和HFDIOR組小鼠腸道擬桿菌門顯著下降，厚壁菌門、梭桿菌門、變形菌門含量顯著升高。HFDIO組和HFDIOR組小鼠腸道在變形菌門、螺旋體門、疣微菌門有一定差異，而在厚壁菌門、梭桿菌門、變形菌門差異上有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。
　　4.宏基因組多樣性分析:多樣性分析分為α多樣性分析和3多樣性分析。通過α多樣性分

8、析發(fā)現(xiàn)Control組腸道菌群多樣性遠高于高脂組小鼠，HFDIO組和HFDIOR組差異不明顯。通過β多樣性分析發(fā)現(xiàn)，Control組、HFDIO組與HFDIOR組無論在物種組成，基因功能還是代謝途徑上都存在較大差異。物種組成上，高脂飲食誘導的2組小鼠趨于相似，并有交互，但與對照組有較大差距，聚類分析提示有性別差異;而在基因功能和代謝途徑上，3組小鼠都有明顯差異，Control組與HFDIOR組距離較近，提示在關鍵基因功能上HFDIOR組

9、小鼠的腸道菌群未受到較大損傷，HFDIO組小鼠可能已處于代謝紊亂狀態(tài)。
　　5.宏基因組關鍵生物標記物的篩選:通過線性判別效應量(LEfSe)分析，發(fā)現(xiàn)Control組的關鍵物種是擬桿菌屬和普雷沃氏菌屬，從屬于擬桿菌門;HFDIO組的關鍵物種只有Lachnospiraceae bacterium28-4，從屬于厚壁菌門;HFDIOR組最關鍵的物種是Lachnospiraceae bacterium10-1，從屬于厚壁菌門。

10、　　6.GO功能顯著性差異分析:通過基因本體(Gene Ontology,GO)數(shù)據(jù)庫分析比對，我們發(fā)現(xiàn)，HFDIO組和HFDIOR組小鼠在細胞組成、分子功能、生物學途徑都存在較大差異，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）的共有23項，重要差異有氧還原酶活性、轉(zhuǎn)移酶活性、核酸結合活性。
　　7.KEGG Pathway差異分析:通過將基因與KEGG(京都基因與基因組百科全書)數(shù)據(jù)庫中的代謝通路分析數(shù)據(jù)庫比對，我們發(fā)現(xiàn)，HFDIO組和H

11、FDIOR組小鼠存在較大差異，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)的共有17項，關鍵差異集中在碳水化合物代謝。
　　8.高脂飲食誘導的小鼠腸道病毒物種注釋與物種豐度分析:通過比對NCBI的nr、virus數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，相比Control組，HFDIO組和HFDIOR組小鼠腸道肌尾噬菌體科、微小噬菌體科有所下降，HFDIOR組短尾噬菌體科下降明顯。HFDIO組和HFDIOR組小鼠腸道病毒未發(fā)現(xiàn)顯著差異(P＞0.05）。
　　9.病毒

12、組與腸道細菌關聯(lián)網(wǎng)絡分析:18類病毒與46種細菌產(chǎn)生183條關聯(lián)網(wǎng)絡線條，其中82條為負相關，其余101條為正相關。首次在小鼠腸道中發(fā)現(xiàn)大量主要宿主為擬桿菌屬的crAssphage。
　　綜上所述，通過宏基因組對高脂飲食誘導的肥胖小鼠和肥胖抵抗小鼠在腸道菌群群落結構組成，關鍵物種，基因功能和代謝途徑的比較得出，高脂飲食誘導的肥胖組和肥胖抵抗組小鼠在個體肥胖易感性上確實有很大不同，推測關鍵菌群的基因功能對肥胖的發(fā)生或抵抗有著重要的作