嗜酸性粒細胞在AERD患者PGD2產生中的作用及相關機制的研究.pdf

1、阿司匹林耐受不良呼吸道疾病(Aspirin-exacerbated respiratory disease，AERD)以哮喘、鼻息肉及阿司匹林不耐受為特點，即患者服用或吸入阿司匹林或其它非選擇性環(huán)氧合酶-1（cyclooxygenase-1，COX-1）抑制劑后出現急性呼吸系統(tǒng)反應，又稱Samter's三聯征。國外的研究表明，該病大約占成人哮喘的7％，但占了重度哮喘的14％，我國關于該病的報道較少，但近年來，隨著阿司匹林在我國的廣泛應用

2、，AERD的發(fā)病率和檢出率正在不斷增高。
　　AERD是公認的難治性鼻竇炎的一種，目前尚無有效的治療方法，患者通常經過多次鼻內鏡鼻竇手術，但扔不能阻止鼻息肉復發(fā)，需要長期應用糖皮質激素以控制哮喘等癥狀，部分患者在接觸阿司匹林后甚至出現危及生命的哮喘。在阿司匹林高敏反應的過程中，包括半胱氨酸白三烯(Cysteinyl leukotrienes，CysLTs)、類胰蛋白酶、ECP、前列腺素D2(Prostaglandin D2，PGD

3、2)在內的多種介質釋放增多，而5-LO(Lipoxygenase，LO)-LTC4酶通路代謝異常，產生過量的CysLTs而誘發(fā)氣管收縮、分泌增加及嗜酸性粒細胞(Eosinophil，EOS)浸潤被認為是AERD的主要病理機制，但這并不能解釋所有的現象，特別是在阿司匹林脫敏治療過程中發(fā)現有相當一部分患者無法耐受脫敏治療，而這部分患者血液中的PGD2含量顯著高于耐受治療者，并且這種PGD2的增高與患者氣道阻塞的嚴重程度呈正相關，進一步提示了

4、PGD2在AERD發(fā)病中的重要作用。
　　作為花生四烯酸經COX代謝途徑的重要產物，PGD2可以引起氣管痙攣，血管擴張，EOS浸潤，樹突狀細胞活化和遷移等多種作用，在AERD的發(fā)病中發(fā)揮了重要作用?，F有的研究發(fā)現，AERD患者血液中PGD2及其代謝產物含量顯著高于阿司匹林耐受性哮喘(Aspirin tolerant asthma，ATA)患者，而且在AERD患者服用阿司匹林后會進一步升高，但關于PGD2來源的問題卻存在較大爭議，傳

5、統(tǒng)的觀念一直認為肥大細胞是PGD2的主要來源，因為促進PGD2生成的前列腺素合成酶(hematopoietic prostaglandin D2 synthase，hPGDS)，過去僅在肥大細胞中被檢測到。但近年來隨著抗體特異性、敏感性的提高及檢測技術的進步，某些EOS中也檢測到了hPGDS的表達，但關于AERD患者的EOS是否能表達hPGDS并進一步合成釋放具有生物活性的PGD2及其相關調控機制等問題，至今仍無相關研究。
　　目

6、的：
　　通過對AERD患者鼻息肉及外周血EOS合成、釋放PGD2及其相關機制的研究，明確EOS在AERD患者PGD2釋放中的作用及相關調控機制，進一步揭示AERD的病理生理過程及發(fā)病機制，并為該病的靶向干預提供理論基礎。
　　方法和結果：
　　1、鼻息肉及鼻竇粘膜中hPGDS在mRNA水平的差異表達
　　hPGDS是PGD2合成的限速酶，可以促進PGH2向PGD2轉化，我們通過qPCR對9例AERD、17例CH

7、ES患者的鼻息肉及9例對照組鼻竇粘膜hPGDS在mRNA水平的表達進行了檢測，結果顯示AERD患者鼻息肉中hPGDS在轉錄水平的表達要顯著高于其它兩組(p＜0.05)。
　　2、鼻息肉及鼻竇粘膜的hPGDS免疫熒光染色
　　為了明確鼻息肉及鼻竇粘膜組織中hPGDS在蛋白水平的表達及其細胞來源，我們對AERD、慢性增生性嗜酸性粒細胞性鼻竇炎(Chronic hyperplasticeosinophilic sinusitis，

8、CHES)的鼻息肉及對照組鼻竇粘膜進行了hPGDS的免疫熒光染色。結果顯示對照組鼻竇粘膜中幾乎沒有hPGDS陽性染色;CHES鼻息肉中檢測到了中等程度表達的hPGDS陽性染色;而高強度的hPGDS染色幾乎都出現在了AERD患者的鼻息肉中。且陽性細胞絕大多數來源于雙葉核的EOS。
　　我們進一步分析并計算了陽性EOS占總EOS的比例，顯示AERD組顯著高于CHES(p＜0.05)及對照組(p＜0.05)，表明AERD患者的單個EOS

9、有更強的hPGDS表達能力;而計算陽性EOS占總陽性細胞的比例顯示AERD組顯著高于CHES(p＜0.05)及對照組(p＜0.01)，這表明AERD中的EOS對于陽性染色的貢獻顯著高于其它兩組，反映了EOS在AERD患者hPGDS表達中發(fā)揮了更為重要的作用，是hPGDS的重要甚至是主要來源。
　　3、外周血純化嗜酸性粒細胞hPGDS的表達
　　前期的實驗中我們成功證實了AERD患者的鼻息肉在mRNA及蛋白水平均高表達hPGD

10、S，并且免疫熒光的結果顯示這種高表達較多的來源于EOS，因此我們進一步分離純化了人外周血EOS，并對其hPGDS表達情況進行檢測。qPCR檢測結果顯示AERD患者外周血純化EOS的hPGDS在mRNA水平的表達要顯著高于哮喘組及對照組(p＜0.05); Western Blot法檢測的結果表明AERD患者純化EOS的hPGDS在蛋白水平的表達量要顯著高于對照組(p=0.01)及哮喘組患、者(p＜0.05)。這直接證明了AERD患者EOS

11、在mRNA及蛋白水平均具有更強的hPGDS合成能力，同時也表明了除去組織內的高表達外，AERD患者外周血EOS的hPGDS也是高表達的。
　　4、嗜酸性粒細胞PGD2釋放的檢測及阿司匹林刺激實驗
　　前面的研究證實了EOS在mRNA和蛋白水平可以成功的表達hPGDS，并且AERD患者的EOS是高表達的，表明其具備了PGD2的合成能力，但這種高表達并不一定意味著EOS可以合成并釋放具有生物活性的PGD2。因此，為了驗證EOS是

12、否能合成并釋放PGD2，我們通過EIA法直接測定了純化EOS釋放的PGD2。并進一步檢測了LysASA刺激對PGD2釋放量的影響。結果顯示，所有EOS均檢測到了PGD2釋放，同時，隨著LysASA的刺激濃度增加，PGD2的釋放量也逐步增加，表明了LysASA可以促進EOS釋放PGD2。進一步的分析表明，無論是在刺激前還是刺激后，AERD組的EOS，其上清液PGD2含量均高于哮喘組及對照組。
　　5、IFN-γ對嗜酸性粒細胞表達hP

13、GDS及合成PGD2影響的研究
　　上面的研究表明AERD患者的EOS高表達hPGDS并具有更強的PGD2分泌能力，為了進一步研究其高表達hPGDS及釋放PGD2的機制。我們首先通過IFN-γ、IL5、IL4、IL13刺激純化的健康人外周血EOS，然后通過qPCR檢測其hPGDS表達量的變化，結果顯示各種因子刺激前后，hPGDS的表達沒有顯著的變化，表明細胞因子對已經分化成熟的EOS調節(jié)能力較弱。
　　我們進一步將研究的重點

14、轉向由CD34+造血干細胞分化成熟的EOS，在IFN-γ及非IFN-γ環(huán)境中將健康人純化CD34+造血干細胞誘導分化為成熟的EOS，進一步通過qPCR檢測成熟后EOS的hPGDS的表達，結果顯示IFN-γ環(huán)境中成熟的EOS的hPGDS表達顯著升高。而進一步通過EIA檢測其上清液中PGD2的含量，顯示IFN-γ組上清液中PGD2的含量顯著高于非IFN-γ組，并且在LysASA刺激后顯示了更強的PGD2釋放能力。
　　結論：
　

15、　1.AERD患者鼻息肉中hPGDS在mRNA及蛋白水平高表達，AERD患者鼻息肉嗜酸性粒細胞表達了更高的hPGDS，并且相比肥大細胞，這種表達更加廣泛，嗜酸性粒細胞在其中起了更為重要的作用。
　　2.AERD外周血純化的嗜酸性粒細胞高表達hPGDS，并且可以進一步合成釋放PGD2。
　　3.阿司匹林能夠刺激嗜酸性粒細胞釋放PGD2，AERD患者的嗜酸性粒細胞能夠釋放更多PGD2，并且對阿司匹林的刺激更敏感，這可能是AERD