南美響尾蛇神經(jīng)毒素(Crotoxin)誘導(dǎo)NCI-H661細(xì)胞凋亡機(jī)制研究.pdf

1、目的：觀察南美響尾蛇神經(jīng)毒素(crotoxin，CrTX)對人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞體外培養(yǎng)抗腫瘤作用，以及對人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤抗腫瘤作用，并探討其相關(guān)作用機(jī)制。
　　方法：通過四唑鹽還原法(CCK-8)檢測南美響尾蛇神經(jīng)毒素(crotoxin)、吉非替尼(Gefinitib)及兩藥聯(lián)合應(yīng)用對人大細(xì)胞肺癌NCI-H661細(xì)胞的生長抑制率，應(yīng)用細(xì)胞集落平板克隆實驗觀察crotoxin、gefinitib及兩藥聯(lián)合應(yīng)用對NCI-H66

2、1細(xì)胞的集落形成的影響；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測crotoxin、gefinitib及兩藥聯(lián)合應(yīng)用對NCI-H661細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率的影響，并檢測以SB203580抑制p38活性，以PFT-α抑制wtp53的活性后NCI-H661細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率的變化；應(yīng)用蛋白免疫印跡法(Western blot)測定 crotoxin、gefinitib及兩藥聯(lián)用對 NCI-H661細(xì)胞內(nèi) p38MAPK、wtp53、phospho-p38MAPK

3、、bax、bcl-2及 caspase-3活性亞單位 p17蛋白表達(dá)水平影響，并測定以SB203580抑制p38活性，以PFT-α抑制wtp53的活性后crotoxin、gefinitib及兩藥聯(lián)合應(yīng)用對 NCI-H661細(xì)胞內(nèi)以上6種蛋白表達(dá)水平變化。將人大細(xì)胞肺癌NCI-H661細(xì)胞接種裸鼠腋下建立荷瘤裸鼠模型。將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為6組，crotoxin組、gefinitib組、crotoxin+gefiniti組、crotoxin+

4、SB203580組、crotoxin+PFT-α組和陰性對照組。實驗組裸鼠腹腔注射給藥，每三天給藥一次，同時陰性對照組注射等量生理鹽水。給藥4周后完整取出皮下移植瘤結(jié)節(jié)，對比較不同干預(yù)組和對照組移植瘤瘤重，計算抑瘤率。
　　結(jié)果：Crotoxin對NCI-H661細(xì)胞有生長抑制作用，與gefinitib聯(lián)用可增強(qiáng)gefinitib抗腫瘤效果,與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Crotoxin對NCI-H661細(xì)胞集落形

5、成有抑制作用，與gefinitib聯(lián)用可增強(qiáng)gefinitib對NCI-H661細(xì)胞集落形成抑制效果，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Crotoxin對人大細(xì)胞肺癌 NCI-H661細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡和細(xì)胞周期G1期阻滯作用，且crotoxin與gefinitib聯(lián)用可增強(qiáng) gefinitib對 NCI-H661細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡和細(xì)胞周期 G1期阻滯作用，以SB203580抑制p38活性，以PFT-α抑制wtp53的活性后，cro

6、toxin誘導(dǎo)凋亡和細(xì)胞周期G1期阻滯作用可被抑制。Western blot實驗中crotoxin、 gefinitib、crotoxin+gefinitib組中 phospho-P38MAPK、wtP53、caspase3活性亞單位 P17、bax蛋白表達(dá)水平與對照組相比表達(dá)增高，且crotoxin、 gefinitib組表達(dá)量接近，Crotoxin+Gefinitib組高于前兩者； bcl-2蛋白表達(dá)水平較對照組下調(diào)，且crotox

7、in+gefinitib組低于crotoxin、gefinitib組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。crotoxin+SB203580組中phospho-P38MAPK、wtP53、caspase3活性亞單位 P17、bax、bcl-2蛋白表達(dá)水平與對照組相接近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 Crotoxin+PFT-α組中phospho-P38MAPK、wtP53蛋白表達(dá)水平比對照組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；caspase3活性亞單位 P17、bax、bcl-

8、2蛋白表達(dá)水平與對照組無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。各組中 p38MAPK蛋白表達(dá)水平接近對照組，無統(tǒng)計學(xué)差異。Crotoxin，gefinitib均對人大細(xì)胞肺癌NCI-H661細(xì)胞移植瘤生長有抑制作用，二者聯(lián)合應(yīng)用可顯著提高抑瘤作用,其抑瘤率分別是39.5％、43.7%及75.1%，與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：Crotoxin對人大細(xì)胞肺癌NCI-H661細(xì)胞體外生長有抑制作用，與gefini