基于BrdU的SuzukI-Miyaura偶聯(lián)在檢測細胞增殖中的應用研究.pdf

1、細胞增殖是生物體重要的生命特征，也是生物體生長、發(fā)育、繁殖以及遺傳的基礎。細胞增殖檢測技術(shù)被廣泛地應用于抗腫瘤藥物篩選、DNA復制的研究、干細胞研究、有機化合物和納米材料的毒性評價以及腫瘤放射敏感性評價等。檢測DNA復制的方法在單細胞水平直接檢測細胞增殖，是檢測細胞增殖最準確的方法。BrdU/抗體免疫，EdU/點擊化學，VdU/Inverse Diels-Alder反應是當前最常見的三種檢測DNA復制的方法。這些檢測細胞增殖的方法都有各

2、自的優(yōu)缺點，其中的一些不足會限制它們的應用。因此，發(fā)展一種新的方法可以彌補這些方法的不足之處，為細胞增殖檢測提供更多的選擇。Suzuki-Miyaura反應是有機硼化合物與有機鹵或者有機擬鹵在鈀或者鎳的催化下發(fā)生的交叉偶聯(lián)反應，廣泛應用于有機合成。近些年該反應也被用于修飾及標記多糖、蛋白質(zhì)、多肽及寡核苷酸和DNA等細胞組份。希望將Suzuki-Miyaura化學偶聯(lián)方法應用于標記增殖細胞DNA中所摻入的BrdU，從而實現(xiàn)細胞增殖的檢測。

3、
　　首先在70℃的條件下以BrdU和苯硼酸為底物在四種溶劑中驗證了該反應的可行性。然后，在37℃使用不同的催化體系優(yōu)化反應。結(jié)果表明使用n-Bu4N+OH-為堿時得到最佳實驗結(jié)果，可以進一步應用于增殖細胞標記。在合成七種含硼酸基的染料的基礎上，經(jīng)過化學反應，DNA分子水平以及細胞水平的多次實驗摸索，以排除各種不利于細胞Suzuki-Miyaura偶聯(lián)標記的因素。排除這些因素后，初步獲得了可以用于增殖細胞標記的條件。
　　經(jīng)

4、重新優(yōu)化BrdU和苯硼酸的反應并獲得最佳反應條件后，使用三種染料硼酸和BrdU為模板的反應表明染料硼酸可以和BrdU生成相應的偶聯(lián)產(chǎn)物。在固定化細胞中，考察在四種條件下PdNP催化偶聯(lián)標記，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氫氣保護條件下可得到滿意的結(jié)果。該方法下，DTBPPS支持的鈀納米顆粒和摻入細胞中的BrdU在氬氣保護下發(fā)生氧化加成，再在氫氣條件下與染料硼酸完成偶聯(lián)標記。進一步優(yōu)化染料濃度，鈀的用量以及標記時間，從而得到最佳增殖細胞標記條件。
　　使

5、用不同方法驗證了BrdU/Suzuki-Miyaura偶聯(lián)標記方法的可靠性。結(jié)果顯示，1）HepG2，SH-SY5Y，MDA-MB-231，HeLa以及A172細胞中遞增BrdU濃度和偶聯(lián)標記的熒光強度成正比;2）HepG2細胞中遞增BrdU孵育時間標記的熒光強度成正比;3）用Aphidicolin阻滯細胞周期可阻斷標記;4）BrdU-EdU共定位實驗表明BrdU/S uzuki-Miyaura偶聯(lián)標記與EdU/點擊化學標記兩種方法互相

6、兼容，且兩種方法都特異性的標記增殖細胞。
　　將該方法應用于腫瘤組織中檢測增殖細胞，結(jié)果表明經(jīng)過偶聯(lián)標記后，可以很容易地區(qū)分增殖細胞和未增殖細胞。與EdU/點擊化學的方法聯(lián)合以用于追蹤DNA合成的Pulse-Chase實驗，結(jié)果表明增殖細胞被單色或兩色標記，兩種標記信號在時間和空間上具有可辨性。使用綠色熒光染料硼酸DEAC-硼酸及FITC-硼酸標記增殖細胞，結(jié)果表明兩種硼酸染料均能特異性地標記擴增細胞，DEAC硼酸標記結(jié)果理想而F