DNA末端定量及其在細(xì)胞凋亡檢測中的應(yīng)用研究.pdf

1、細(xì)胞凋亡已成為世界生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，其重要意義在于有可能闡明多種疾病包括病毒感染、神經(jīng)退化性疾病、免疫缺陷和惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)理，并為這些疾病治療探索新的方法。最近，有學(xué)者重點(diǎn)闡述了細(xì)胞凋亡與臨床疾病的關(guān)系，細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制和實(shí)驗(yàn)室檢測在細(xì)胞凋亡評估過程中的重要作用。由此可知，研究細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)室檢測體系非常重要，同時(shí)，其檢測方法不斷涌現(xiàn)，分析手段日趨完善和成熟。按方法學(xué)可分為形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)和分子生物學(xué)測定法。也可將其

2、分為以下七類，即(1)形態(tài)學(xué)檢測；(2)流式細(xì)胞分析；(3)DNA降解分析；(4)凋亡細(xì)胞膜改變分析；(5)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白分析；(6)細(xì)胞凋亡酶學(xué)分析；(7)其它細(xì)胞凋亡檢測法。 目前檢測DNA降解的方法主要有電泳、流式細(xì)胞分析、原位術(shù)端標(biāo)記(TUNEL)和PCR法等。我們欲利用α32磷脫氧三磷酸胞苷(α32pdCTP)與雙脫氧三磷酸胞苷(ddCTP)在外源性終末核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)的催化作用下，對同一DNA樣本的3’-羥基

3、末端進(jìn)行飽和標(biāo)記，建立定量DNA末端最大標(biāo)記量(Lmax)的方法(TdT法)，并將Lmax與流式細(xì)胞分析(FCA)等檢測結(jié)果進(jìn)行比較。同時(shí)，利用DNA末端定量技術(shù)檢測不同年齡高血壓大鼠(SHR)心肌細(xì)胞凋亡的動(dòng)力學(xué)關(guān)系，并通過其探討雷米普利治療SHR，研究ACE抑制劑對心肌細(xì)胞凋亡的影響。 在DNA末端定量應(yīng)用于細(xì)胞凋亡檢測中的研究中，我們以P2z受體的激活劑如三磷酸腺苷(ATP)、苯甲酰苯甲酸ATP(BzATP)等，或抑制劑如

4、氧化型ATP(OxATP)作用于P2z(+)與P2z(-)CLL細(xì)胞，采用TdT法以及電鏡、DNA凝膠電泳檢測細(xì)胞凋亡，觀察P2z受體介導(dǎo)CLL細(xì)胞凋亡中的作用。同時(shí)，探討影響P2z受體介導(dǎo)CLL細(xì)胞凋亡的各種影響因素，包括各種二價(jià)陽離子、EDTA或EGTA、溫度及在膽堿介質(zhì)中的P2z(+)CLL細(xì)胞經(jīng)ATP或BzATP誘導(dǎo)凋亡的激活或抑制效應(yīng)及其可能機(jī)理。 本研究共分四部分，包括第一部分DNA末端定量檢測方法的建立；第二部分D

5、NA末端定量在雷米普利抑制自發(fā)性高血壓大鼠細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用；第三部分DNA末端定量在P2z受體誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用；第四部分DNA末端定量在P2z受體介導(dǎo)淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡機(jī)理研究中的應(yīng)用。 目的：(1)建立一種定量檢測DNA末端的方法；(2)利用DNA末端定量技術(shù)探討細(xì)胞凋亡與自發(fā)性高血壓之間的關(guān)系，以及血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑對心肌細(xì)胞凋亡的影響；(3)利用DNA末端定量技術(shù)研究嘌呤能P2z受體在ATP誘導(dǎo)淋

6、巴細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡中的作用；(4)利用DNA末端定量技術(shù)研究二價(jià)陽離子和膽堿等因素在ATP誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡中的作用。 方法：(1)首先，我們參照有關(guān)文獻(xiàn)建立了用雙脫氧三磷酸胞苷(ddCTP)與α32磷脫氧三磷酸胞苷(α32PdCTP)，在外源性終末核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)的催化作用下，標(biāo)記并定量斷裂DNA的3’-羥基末端，以評價(jià)DNA的降解程度，并與已知定量檢測N-Ras基因的PCR法結(jié)果進(jìn)行比較；然后，在原有利用α3

7、2磷脫氧三磷酸胞苷(α32PdCTP)標(biāo)記DNA末端的基礎(chǔ)上，利用α32磷脫氧三磷酸胞苷(α32pdCTP)與雙脫氧三磷酸胞苷(ddCTP)在外源性終末核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)的催化作用下，對同一DNA樣本的3’-羥基末端進(jìn)行飽和標(biāo)記，建立定量DNA末端最大標(biāo)記量(Lmax)的方法(TdT法)，并將Lmax與流式細(xì)胞分析(FCA)、原位末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)、凝膠電泳檢測結(jié)果進(jìn)行比較。 (2)利用DNA末端定量檢測細(xì)胞凋亡的方

8、法等觀察不同年齡高血壓大鼠(SHR)心肌細(xì)胞凋亡的動(dòng)力學(xué)關(guān)系，并通過雷米普利治療SHR研究ACE抑制劑對心肌細(xì)胞凋亡的影響。 (3)以P2z受體的激活劑如三磷酸腺苷(ATP)、苯甲酰苯甲酸ATP(BzATP)等，或抑制劑如氧化型ATP(OxATP)作用于P2z(+)與P2z(-)的CLL細(xì)胞，同時(shí)，采用建立的TdT法探討P2z受在介導(dǎo)CLL細(xì)胞凋亡中的作用。 (4)探討影響P2z受體介導(dǎo)CLL細(xì)胞凋亡的各種影響因素，包括

9、各種二價(jià)陽離子、EDTA或EGTA、溫度及在膽堿介質(zhì)中的P2z(+)CLL細(xì)胞經(jīng)ATP或BzATP誘導(dǎo)凋亡的激活或抑制效應(yīng)及其可能的機(jī)理。 (二)本研究以DNA末斷標(biāo)記法證實(shí)了雷米普里治療可以阻止高血壓的形成，甚至停藥后還可維持著一定作用。在對不同的WKY與SHR心肌細(xì)胞凋亡的研究中，發(fā)現(xiàn)SHR細(xì)胞DNA末端量與正常對照鼠(WKY)相比差異非常顯著(P＜0.01)，前者DNA末端量顯示鼠齡依賴性增加，而后者DNA末端量基本無變化

10、。 (三)利用DNA末端定量技術(shù)探討通過表達(dá)P2z受體的CLL細(xì)胞能介導(dǎo)由ATP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡并出現(xiàn)其特征性變化；不同的P2z受體激活劑可通過P2z受體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并產(chǎn)生不同量的DNA片段，誘導(dǎo)能力的強(qiáng)弱順序是BzATP＞ATP＞2MeSATP，而ATP-γS或其他核苷幾乎無誘導(dǎo)能力；P2z受體的抑制劑可特異阻斷經(jīng)其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡發(fā)生；參與P2z受體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的激活劑與激活P2z受體的激活劑完全一致，證實(shí)了P2z受體在介導(dǎo)細(xì)胞

11、凋亡過程中具有特殊作用。 (四)在利用DNA末端定量技術(shù)對ATP誘導(dǎo)P2z陽性CLL細(xì)胞凋亡機(jī)理的研究中發(fā)現(xiàn)，陰性對照或二價(jià)陽離子對照P2z(+)CLL細(xì)胞的DNA末端量無顯著性差異(P＞0.05)；Sr2+、Co2+、Ba2+對ATP誘導(dǎo)P2z(+)CLL細(xì)胞凋亡基本無影響(P＞0.1)；1.0mmol/LZn2+(ZnCl2)幾乎可完全抑制P2z(+)CLL細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的DNA末端量，抑制率達(dá)98.7％；而Ca2+、Mg2+

12、可大大增加ATP誘導(dǎo)P2z(+)CLL細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的DNA末端量，分別較ATP組增加144％(Ca2+)和289％(Mg2+)；ATP誘導(dǎo)P2z(+)CLL細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的DNA末端量隨EDTA和EGTA劑量的增加而減少，其DNA末端產(chǎn)生量的抑制率分別為21％、58％、90％(EGTA)和23％、65％、88％(EDTA)；當(dāng)Zn2+濃度逐漸增加時(shí)，ATP誘導(dǎo)P2z(+)CLL細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的DNA末端量逐漸減少；膽堿對ATP或BzATP誘

13、導(dǎo)P2z(+)CLL細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的DNA末端量的抑制達(dá)52％或58％；當(dāng)溫度低于0℃時(shí)，ATP誘導(dǎo)P2z(+)CLL細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的DNA降解末端完全消失。 結(jié)論：(1)利用α32磷脫氧三磷酸胞苷(α32pdCTP)與雙脫氧三磷酸胞苷(ddCTP)在外源性終末核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)的催化作用下，定量DNA末端最大標(biāo)記量(Lmax)的方法(TdT法)靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確、可靠。 (2)在利用DNA末端定量技術(shù)對不同WKY

14、與SHR心肌細(xì)胞凋亡研究發(fā)現(xiàn)，SHR細(xì)胞DNA末端量與正常對照鼠(WKY)相比差異非常顯著(P＜0.01)，前者DNA末端量顯示鼠齡依賴性增加，而后者DNA末端量基本無變化。同時(shí)，早期雷米普利治療不僅能顯著降低SHR血壓、心臟與體重比，而且能抑制SHR年齡依賴性的細(xì)胞凋亡，使其DNA末端量較未治療SHR組減少70.7％，其Lmax與WKY對照組比較無明顯差異(P＞0.1)。 (3)在利用DNA末端定量技術(shù)對ATP誘導(dǎo)P2z陽性C

15、LL細(xì)胞凋亡的研究中發(fā)現(xiàn)，DNA末端量呈誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)時(shí)間依賴性增加，而P2z陰性CLL細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)劑作用后則不發(fā)生DNA末端量的增加。 (4)ATP誘導(dǎo)P2Z(+)細(xì)胞凋亡中，Mg2+或Ca2+能以劑量依賴性方式促進(jìn)ATP誘導(dǎo)P2Z(+)細(xì)胞凋亡，而EDTA或EGTA卻以相反方式抑制P2Z(+)細(xì)胞凋亡的發(fā)生；1.0mmol/LZn2+可完全阻止ATP誘導(dǎo)P2Z(+)細(xì)胞凋亡所產(chǎn)生的DNA片段，但其他二價(jià)陽離子包括1.0mmo