DSS慢性腸炎中ERβ具有抗炎作用及其機(jī)制探討.pdf

1、目的：炎癥性腸病是一種病因不明確的非特異炎癥性疾病，研究認(rèn)為Th17/Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)紊亂導(dǎo)致的過度炎癥反應(yīng)在疾病發(fā)生中起重要作用,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子3（STAT3）是調(diào)節(jié)Th17/Treg生物學(xué)行為的關(guān)鍵靶點(diǎn)。雌激素受體-β（ERβ）ERβ具有抗炎作用，但ERβ是否對(duì)CD4+T細(xì)胞具有調(diào)節(jié)作用以及相關(guān)的機(jī)制目前尚無明確的研究。本課題旨在通過小鼠DSS慢性炎癥模型探討ERβ是否具有抗炎作用，進(jìn)一步了解是否可以通過調(diào)節(jié)STAT3

2、介導(dǎo)來干預(yù)Th17/Treg細(xì)胞分化和效應(yīng)而發(fā)揮其抗炎作用。
　　方法：將C57bl/6J小鼠隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組（A）、DSS組（B）和DSS+ERB-041組（C）。干預(yù)：飲用2％DSS5天+飲用水4天，共3個(gè)循環(huán)；C組預(yù)先用ERB-041（ERβ激動(dòng)劑，10mg/Kg/day/per）灌胃3天，隨之同時(shí)予DSS和ERB-041干預(yù)。每天定時(shí)觀察記錄小鼠體質(zhì)量、大便性狀及便血；處死小鼠后，取結(jié)腸標(biāo)本，測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度并觀察大體

3、觀，進(jìn)行組織病理學(xué)和疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)分；實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)IL-17a、TNF-a、IL-10、TGF-β、ERβ、RORγt、Foxp3和SOCS3 mRNA水平；蛋白印記實(shí)驗(yàn)（Western blot）檢測(cè)IL-17a、IL-10、ERβ、Foxp3和SOCS3蛋白水平；免疫熒光雙染觀察3組結(jié)腸Th17/Treg細(xì)胞變化及ERβ是否在CD4+T細(xì)胞中的表達(dá)；借助蛋白質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（Co-IP）檢測(cè)

4、ERβ-p-STAT3復(fù)合物。
　　結(jié)果：1.成功建立模型和ERβ激動(dòng)劑改善小鼠生活狀態(tài)和結(jié)腸組織炎癥：B組與A組小鼠比較，B組體重增長(zhǎng)稍慢（P>0.05），軟便或稀水便帶血，結(jié)腸大體顯示明顯縮短變粗變性(A組vs.B組：6.40±0.3cmvs.5.044±0.2cm，P=0.0003)，DAI和組織病理評(píng)分明顯增高統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異（P<0.05），HE染色示組織炎癥顯著。而 C組小鼠與B組相比，體重、大便、組織炎癥明顯改善，結(jié)腸長(zhǎng)

5、度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（B組vs.C組：5.044±0.2cmvs.6.24±0.3cm，P=0.0009）。2.ERβ激動(dòng)劑上調(diào)腸道ERβ、降低促炎因子和增加抑炎因子表達(dá)：A和B組ERβ mRNA表達(dá)水平相比統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著（A組vs.B組：1.04±0.24vs.0.35±0.08, P=0.0019）, B組和C組也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（B組vs.C：1.04±0.24vs.1.34±0.24，P=0.0018）。ERβ蛋白表達(dá)變化趨勢(shì)與基因水

6、平一致。3組IL-17a和TNF-a mRNA兩兩比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異具有意義：A組vs.B組（IL-17a：0.14±0.02vs.0.56±0.10，P=0.0006；TNF-a：0.88±0.02vs.1.11±0.04，P<0.0001）和B組vs.C組（IL-17a：0.56±0.10vs.0.21±0.04，P=0.0066；TNF-a：0.88±0.02 vs.0.91±0.02，P=0.0008），IL-17a蛋白表達(dá)變化趨

7、勢(shì)與RT-PCR結(jié)果一致。IL-10和TGF-β mRNA比較具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異：A組vs.B組（TGF-β：1.77±0.19vs.0.88±0.11，P=0.0017；IL-10：1.15±0.11vs.0.66±0.07，P=0.0046）和B組vs.C組（TGF-β：0.88±0.11vs.2.04±0.26，P=0.0021；IL-10：0.66±0.07vs.1.25±0.14，P=0.0032），IL-10蛋白表達(dá)水平變化

8、趨勢(shì)與mRNA水平一致。3. ERβ激動(dòng)劑降低Th17細(xì)胞數(shù)量和增加Treg細(xì)胞：免疫熒光示A組和C組Treg細(xì)胞明顯多于B組，而Th17細(xì)胞則顯著少于B組；RT-PCR表明3組間RORγt和Foxp3 mRNA具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異：A組vs.B組（RORγt：1.56±0.28 vs.2.81±0.21，P=0.003；Foxp3：0.77±0.05vs.0.54±0.06，P=0.0079）和B組vs.C組（RORγt：2.81±0

9、.21vs.1.40±0.26，P=0.001；Foxp3：0.54±0.06vs.1.10±0.10，P=0.0003），且Foxp3蛋白變化趨勢(shì)與基因水平一致。4.免疫熒光示ERβ表達(dá)于CD4+T細(xì)胞中；Co-IP結(jié)果表明ERβ-p-STAT3復(fù)合物共存于結(jié)腸；SOCS3 mRNA在3組間的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異：A組vs.B組（1.41±0.19vs.0.71±0.15，P=0.0130）和B組vs.C組（0.71±0.15vs.1.6

10、2±0.20，P=0.0033），與蛋白變化趨勢(shì)一致。
　　結(jié)論：1.ERβ激動(dòng)劑在DSS干預(yù)的慢性小鼠腸炎中具有抗炎作用.2.這種作用是通過ERβ-p-STAT3信號(hào)通路調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞分化和活化發(fā)揮作用：一是通過抑制有關(guān)Th17細(xì)胞分化和效應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子（RORγt）和細(xì)胞因子的表達(dá)，并通過RORγt的下調(diào)間接增加Foxp.3產(chǎn)生而促進(jìn)Treg細(xì)胞分化；一是通過增加SOCS3的產(chǎn)生而發(fā)揮STAT3-Th17細(xì)胞信號(hào)中的