新型可誘導Cre重組酶的構建.pdf

1、目的：DNA重組酶Cre及其作用位點loxP組成的細胞標記系統(tǒng)在研究胰腺發(fā)育及成體胰島Beta形成過程中具有重要作用。本研究組前期研究發(fā)現(xiàn)Cre重組酶嚴重放大胰島素啟動子RIP非特異活性，對此我們采用點突變的方式對Cre進行改造，降低其酶活性，使胰島素啟動子RIP控制的Cre-loxP系統(tǒng)標記胰島Beta細胞的特異性提高約15倍；進一步發(fā)現(xiàn)經(jīng)典的可誘導型Cre，即定位于胞漿的與雌激素受體融合的CreER具有強烈的泄露現(xiàn)象，這使得利用此系

2、統(tǒng)作為研究工具的實驗設計存在明顯漏洞。因此我們對Cre進行徹底改造，構建新型膜定位可誘導Cre標記系統(tǒng)及新型條件內(nèi)含肽激活的Cre標記系統(tǒng)，有望解決CreER的自發(fā)泄露問題，從而提高可誘導Cre-loxP系統(tǒng)的嚴謹性。
　　方法：通過分子生物學技術構建可誘導Cre表達載體pCMV-CreER，pRIP-CreER和pMIP-CreER，檢測CMV啟動子及胰島素啟動子控制下CreER的泄露情況。通過點突變技術構建可誘導的突變型Cre

3、表達載體pCMV-CreER(H289P)和pCMV-CreER(H289T)，分析突變型CreER的自發(fā)泄露現(xiàn)象。我們還構建膜定位Cre表達質粒pCMV-imCre及內(nèi)含肽激活的Cre表達質粒pCMV-ciaCre，以檢測新型可誘導Cre-loxP系統(tǒng)的自發(fā)泄露情況。
　　結果：我們成功構建了可誘導pCMV-CreER，pRIP-CreER和pMIP-CreER表達載體，并驗證發(fā)現(xiàn)CMV，RIP及MIP啟動子控制下CreER存在

4、嚴重泄露現(xiàn)象。通過點突變獲得pCMV-CreER(H289P)和pCMV-CreER(H289T)表達載體驗證發(fā)現(xiàn)，減弱Cre酶活性可以明顯降低CreER的泄露，但細胞標記效率不理想。另外，我們構建了膜定位質粒pCMV-imCre，染色結果表明imCre確實定位在細胞膜上，然而，該系統(tǒng)似乎沒有重組活性。我們又構建了內(nèi)含肽激活的Cre表達質粒pCMV-ciaCre，但目前仍未檢測到該系統(tǒng)的重組活性。
　　結論：CMV及胰島素啟動子控