基于酶擴(kuò)增的新型DNA水凝膠的構(gòu)建及其應(yīng)用.pdf

1、功能水凝膠作為一種新型生物材料，由于其物理機(jī)械性能與生物組織的類似性，已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域一種重要的生物材料。近幾年來，DNA水凝膠得到了快速發(fā)展，由于其優(yōu)異的生物相容性、可降解性以及易于功能化等優(yōu)點(diǎn)，DNA水凝膠在生物傳感、藥物的運(yùn)載與釋放、蛋白的體外表達(dá)以及單細(xì)胞操控等方面都有著廣泛的應(yīng)用。但是以往DNA水凝膠的合成方法中，往往需要大量的DNA作為原料，極大增大了合成成本，限制了DNA凝膠的發(fā)展。因此，本文中，我們基于末端脫氧核苷酸

2、轉(zhuǎn)移酶(TdT)的催化聚合性能，以二維或者三維DNA納米材料作為基本結(jié)構(gòu)單元，開發(fā)了兩種簡便、快捷且成本低的方法構(gòu)建DNA水凝膠，并且將其應(yīng)用于物質(zhì)的包裹及可控釋放，蛋白的富集，和多酶反應(yīng)體系的構(gòu)建，具體如下:
　　1.基于TdT無模板擴(kuò)增DNA的性能，以十字交叉型DNA結(jié)構(gòu)(X-DNA)作為基本結(jié)構(gòu)單元，構(gòu)建了一種合成DNA水凝膠的新方法。該方法中，以X-DNA為引物，通過TdT擴(kuò)增將三磷酸脫氧胸苷(dTTP)和三磷酸脫氧腺苷(

3、dATP)添加至X-DNA的3'-羥基末端，合成四端帶有富含胸腺嘧啶(T)的X-DNA-Tn和富含腺嘌呤(A)的X-DNA-An，然后利用A-T堿基互補(bǔ)配對，自組裝形成DNA水凝膠。本方法中，TdT的引入極大的減少了水凝膠合成中初始DNA的用量，由原來的數(shù)十微摩級別降低到幾個微摩，從而降低了成膠成本。另外，我們考察了這種凝膠形成的機(jī)理，發(fā)現(xiàn)帶有富A序列或者帶有富T序列X-DNA無法單獨(dú)形成凝膠，且以線性DNA為引物合成的富A序列與富T序

4、列的雜交以及錯配堿基（如A/C）的擴(kuò)增產(chǎn)物都無法合成水凝膠。這些結(jié)果表明，該凝膠的合成中以十字交叉型DNA作為中心點(diǎn)，而延伸臂作為交聯(lián)劑，二者缺一不可。接著，利用流變儀、掃描電子顯微鏡、原子力顯微鏡分別表征其力學(xué)性能、表面形貌以及內(nèi)部結(jié)構(gòu)。最后，我們探究了該DNA水凝膠在大分子物質(zhì)的封裝以及可控釋放方面的應(yīng)用。
　　2.利用上述通用型的合成方法構(gòu)建了一種功能DNA水凝膠—DNA酶水凝膠(DNAzyme hydrogel)。將一段D

5、NAzyme(Dz)序列連接于上述X-DNA結(jié)構(gòu)上，形成Dz-X-DNA。該結(jié)構(gòu)在一些陽離子(K+)存在的情況下，能夠形成鳥嘌呤-四鏈體，與氯化血紅素(hemin)結(jié)合后具有模擬過氧化物酶活性，能夠催化H2O2氧化ABTS2-產(chǎn)生綠色產(chǎn)物ABTS-。首先，我們以Dz-X-DNA作為結(jié)構(gòu)單元合成DNAzyme水凝膠，探索了其過氧化物酶活性，并且將其用于H2O2的可視化檢測。基于這一現(xiàn)象，我們發(fā)展了兩種生物酶串聯(lián)體系:結(jié)合葡萄糖氧化酶(GO

6、x)構(gòu)建了雙酶串聯(lián)體系;將GOx以及半乳糖苷酶(β-Gal)固定于凝膠中即可構(gòu)成三酶串聯(lián)反應(yīng)體系。在這些酶聯(lián)體系中，我們合成的凝膠不僅充當(dāng)生物酶的支架，更為重要的是，它還是串聯(lián)反應(yīng)中的一個不可或缺的催化反應(yīng)單元，參與整個酶聯(lián)反應(yīng)的過程。這些有效的酶聯(lián)反應(yīng)為葡萄糖、乳糖提供了一種潛在的檢測方法。
　　3.以三維DNA納米材料—DNA納米管(DNA-nanotube)為基本結(jié)構(gòu)單元，構(gòu)建了一種結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定，機(jī)械性能更強(qiáng)的DNA水凝膠。