基于靶序列環(huán)化的新型滾環(huán)擴(kuò)增方法的建立及其應(yīng)用.pdf

1、核酸擴(kuò)增是一項(xiàng)基本的生物技術(shù),在醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)和取證等各個(gè)方面有著不可替代的作用。傳統(tǒng)的核酸擴(kuò)增使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),即 PCR技術(shù)。作為一種經(jīng)典的擴(kuò)增檢測(cè)方法,同以其為基礎(chǔ)發(fā)展而來的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(qPCR)技術(shù),被廣泛的應(yīng)用于核酸的擴(kuò)增與檢測(cè)領(lǐng)域。但這一技術(shù)在食品領(lǐng)域應(yīng)用時(shí)會(huì)出現(xiàn)易受污染產(chǎn)生假陽(yáng)性,有聚合酶抑制劑時(shí)使用困難,背景核酸大量存在時(shí)靈敏度大幅降低等問題。這些缺點(diǎn)限制了 PCR直接用于檢測(cè)食品中外源微生物。同時(shí),作

2、為一種變溫?cái)U(kuò)增技術(shù),PCR特異性的發(fā)揮需要精確的控溫儀器,不符合基層現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的要求。因此需要開發(fā)一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù),能夠擺脫對(duì)精確控溫儀器的依賴,同時(shí)能夠從食品中檢測(cè)出外源病毒和細(xì)菌,即能夠在大量背景核酸存在的條件下特異性檢測(cè)目標(biāo)序列的存在,以達(dá)到在食品領(lǐng)域真正廣泛應(yīng)用的目標(biāo)。
　　滾環(huán)擴(kuò)增(Rolling circle amplification,RCA),是一種在等溫條件下就能特異性擴(kuò)增目標(biāo)片段的擴(kuò)增技術(shù),主要利用環(huán)狀模

3、板和具有鏈置換能力的DNA聚合酶環(huán)繞模板進(jìn)行周期性的復(fù)制。常見技術(shù)應(yīng)用為都以鎖式探針 RCA(padlock-RCA)引發(fā)擴(kuò)增。雖然靈敏度高,但也有單鏈探針不穩(wěn)定、探針與模板容易錯(cuò)配、擴(kuò)增產(chǎn)物并非目標(biāo)序列而是互補(bǔ)的探針自身的缺點(diǎn)。針對(duì)于此,本文使用了一種全新的目標(biāo)成環(huán)RCA(Target-circularization RCA,TC-RCA):利用限制性內(nèi)切酶酶切樣品,產(chǎn)生具有9 nt粘性末端的序列;其次,設(shè)計(jì)與目標(biāo)序列粘性末端完全互補(bǔ)

4、配對(duì)的雙鏈接頭,在連接酶的作用下同目標(biāo)序列連接成環(huán);利用具有鏈置換活性的 DNA聚合酶,在兩條引物的作用下引發(fā)超分支-RCA(Hyper-branched RCA);最后,擴(kuò)增產(chǎn)物再經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切,得到擴(kuò)增后的目的片段。在此基礎(chǔ)上,利用高特異性的 DNA連接酶、生物素修飾接頭、鏈霉親和素磁珠以及磁性分離等手段,構(gòu)建了磁珠輔助的 TC-RCA技術(shù)。該項(xiàng)技術(shù)能夠在等溫條件下從大量背景核酸中檢測(cè)出目標(biāo)序列,從根本上解決了檢測(cè)特異性和靈敏

5、度之間的矛盾關(guān)系,特別適用于檢測(cè)食品中有害微生物的存在。論文主要從以下幾個(gè)方面研究建立特異性核酸檢測(cè)方法。
　　(1)TC-RCA的可行性,證明了TC-RCA具有在無背景核酸條件下擴(kuò)增目標(biāo)DNA片段的能力,敏感度為6×104個(gè)拷貝分子。同時(shí),接頭能穩(wěn)定結(jié)合于固相磁珠表面,并且設(shè)計(jì)的接頭固定于固相表面后不影響連接與擴(kuò)增,為 TC-RCA在芯片上實(shí)現(xiàn)目標(biāo)成環(huán)等溫?cái)U(kuò)增提供了技術(shù)支持和理論依據(jù)。
　　(2)TC-RCA可以在大量背景

6、核酸中檢測(cè)出目標(biāo)序列,敏感度達(dá)到6×106個(gè)拷貝分子,但結(jié)果伴有非特異性擴(kuò)增。使用連接忠實(shí)度較高的Taq DNA連接酶進(jìn)行連接,沒有能夠達(dá)到提高特異性的目的。主要是由于Taq DNA連接酶在非正常的緩沖液條件下,區(qū)別錯(cuò)配能力降低所致。說明 TC-RCA已經(jīng)初步具備成為一種新型檢測(cè)方法的能力,同時(shí)為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供了解決問題的思路和依據(jù)。
　　(3)通過磁珠輔助將擴(kuò)增子與背景DNA和Taq DNA連接酶分離,同時(shí)結(jié)合其它條件的優(yōu)化探索

7、,使得磁珠輔助的 TC-RCA可以在高背景核酸存在的條件下特異性地?cái)U(kuò)增目的片段,敏感度為60個(gè)拷貝分子,并且沒有任何非特異性擴(kuò)增出現(xiàn)。經(jīng)過對(duì)各個(gè)步驟的精簡(jiǎn)優(yōu)化,檢測(cè)結(jié)果24 h之內(nèi)即可獲得。磁珠輔助的TC-RCA通用性強(qiáng),更適用于基層和現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。
　　(4)磁珠輔助TC-RCA適用于檢測(cè)水產(chǎn)品中有害細(xì)菌,SYBR Green I染色結(jié)果表明該技術(shù)可以特異地檢測(cè)出水產(chǎn)品中的外源細(xì)菌,最低檢測(cè)限達(dá)到100個(gè)細(xì)菌基因序列拷貝分子。同