胸膜肺炎放線桿菌血清10型弱毒株的構(gòu)建和環(huán)介導(dǎo)的APP apxIV恒溫?cái)U(kuò)增方法的建立.pdf

1、由豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae，MHP)和胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae,APP)單獨(dú)感染或混合感染是引起目前呼吸道綜合癥的主要原因之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的危害。豬傳染性胸膜肺炎弱毒疫苗是一種新型疫苗，優(yōu)于傳統(tǒng)的滅活疫苗，它可以激發(fā)良好的體液免疫、細(xì)胞免疫和粘膜免疫，具有良好的抗體反應(yīng)和不同血清型菌感染的交叉保護(hù)，而且使用方便、成本低，是當(dāng)前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)

2、。 針對臨床中這兩種病原同時(shí)感染或繼發(fā)感染的現(xiàn)狀，而分別接種單獨(dú)的疫苗會造成豬只的應(yīng)激和養(yǎng)殖成本增加，以致弱的胸膜肺炎放線桿菌表達(dá)MHP主要抗原蛋白的突變株，并研制有效的基因工程疫苗，是預(yù)防這兩種呼吸道傳染病的策略。 本研究以APP血清10型菌株和豬肺炎支原體為材料，分別克隆APP毒素apxI操縱子的調(diào)節(jié)基因apxIC以及MHP主要免疫原性蛋白——乳酸脫氫酶(P36)基因，將P36基因插入到apxIC，構(gòu)建含抗生素標(biāo)記和

3、負(fù)向篩選標(biāo)記的中間轉(zhuǎn)移載體pEICALDH。將pEICALDH熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌X7213感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化的陽性子再與胸膜肺炎10型菌進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)，通過同源重組，在DAP缺乏的含NAD的TSA培養(yǎng)基上，利用營養(yǎng)缺陷篩選法和SacB負(fù)向篩選法，獲得P36基因插入apxIC基因的APP突變株，該突變株不含抗生素抗性基因，用突變株培養(yǎng)上清，濃縮后進(jìn)行westernbolt檢測，發(fā)現(xiàn)濃縮蛋白能與毒素I單抗反應(yīng)。將該毒株劃線接種于含綿羊紅細(xì)

4、胞和NAD的TSA培養(yǎng)基上，觀察24-72個(gè)小時(shí)，未發(fā)現(xiàn)溶血現(xiàn)象，說明該突變株喪失了親本菌株所具有的溶血活性。將107CFU/ml的突變株和親本菌分別接種10只Balb/C小鼠，連續(xù)觀察14天，親本菌在接種后24小時(shí)內(nèi)小鼠全部死亡，而突變株接種組小鼠死亡3只，TSB接種組小鼠全部存活，說明突變株對小鼠的毒力下降；用2×106CFU/ml重組菌免疫Balb/C小鼠，一個(gè)月后用2×108CFU/ml親本菌攻擊免疫鼠，保護(hù)率為100％，而TS

5、B對照組小鼠全部死亡。這些結(jié)果說明，該突變株有望用于疫苗研究。 環(huán)介導(dǎo)的基因擴(kuò)增技術(shù)(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增方法，具有特異、高效、快速的特征。利用水浴鍋以及基于apxIV基因設(shè)計(jì)的6個(gè)特異性引物，LAMP可以在30分鐘內(nèi)快速檢測胸膜肺炎放線桿菌。通過加入SYBRGreenI染料，擴(kuò)增產(chǎn)物可以肉眼觀察。LAMP法檢測胸膜肺炎放線桿菌的特異性與Ne