豬胸膜肺炎放線桿菌(App)感染小鼠模型的建立及黏附素Adh的生物信息學(xué)分析.pdf

1、豬胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillu spleuropneumoniae，App）是引起豬傳染性胸膜肺炎疾病的首要病原菌，在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病病原之一。我國流行的豬傳染性胸膜炎主要由胸膜肺炎放線桿菌血清型1型、3型、5型、7型引起。目前，針對該菌株所建立的動(dòng)物模型，多為藥物評價(jià)模型，缺乏系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染模型。本研究選用SPF級的昆明小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，分別建立App-S1型、App-S7型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染

2、模型，在小鼠上成功復(fù)制出胸膜肺炎的經(jīng)典病例，并針對兩種血清型的菌株分別進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用生物信息學(xué)方法對自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素的結(jié)構(gòu)和功能分析。
　　本論文的研究研究內(nèi)容和成果主要如下：
　　一、App-S1小鼠感染模型的建立
　　針對我國流行菌株App-S1，選用SPF級的昆明小鼠作為建模動(dòng)物，試驗(yàn)證明該菌株對昆明小鼠有強(qiáng)致病性，其半數(shù)致死量LD50為4.48×105.85cfu。從組織病理學(xué)結(jié)果顯示，感染小鼠呈現(xiàn)肺臟、脾臟、

3、和腎臟多器官組織的炎癥變化，伴有較為嚴(yán)重的出血現(xiàn)象，具有典型的肺炎及胸膜炎癥狀。結(jié)果顯示，App-S1型菌對小鼠有較強(qiáng)的毒力，有極強(qiáng)的致病性及致死性。本實(shí)驗(yàn)成功人工模擬胸膜肺炎放線桿菌1型菌株的感染小鼠模型。
　　二、App-S7小鼠感染模型的建立
　　針對流行菌株App-S7，選用SPF級的昆明小鼠作為建模動(dòng)物，驗(yàn)證App-S7對昆明小鼠具的致病性。組織病理學(xué)觀察結(jié)果顯示，感染小鼠不具有典型的肺炎及胸膜炎等癥狀，臨床觀察中

4、也沒有明顯的臨床特征，無死亡現(xiàn)象。結(jié)果表明，App-S7型菌株為弱毒株，毒力較弱且對于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明小鼠不具有致病性。
　　三、App-S1和App-S7交叉保護(hù)試驗(yàn)
　　選擇毒力較強(qiáng)的1型菌株和毒力較弱的7型菌株進(jìn)行交叉免疫保護(hù)試驗(yàn)研究。先用App-S7型菌株制備抗原，分別采用活菌免疫和滅活菌免疫，對小鼠進(jìn)行免疫，經(jīng)檢測產(chǎn)生抗體后，用10倍LD50劑量的App-S1菌對小鼠攻毒，計(jì)算其保護(hù)效率，驗(yàn)證1型菌株與7型菌株之間是否

5、存在有交叉保護(hù)。結(jié)果表明，接種7型菌的活菌免疫抗原及滅活菌免疫抗原的小鼠均對1型菌有免疫保護(hù)，保護(hù)率分別為80％和60%，二者之間存在交叉保護(hù)作用，活菌免疫的效果優(yōu)于滅活菌免疫的效果。
　　四、App的優(yōu)化培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)
　　基于巧克力、腦心浸液、血平板三種培養(yǎng)基的App優(yōu)化培養(yǎng)，結(jié)果顯示，App在巧克力固體培養(yǎng)基上生長狀況優(yōu)于其他兩種培養(yǎng)基。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，針對App-S1型菌株，藥物氟哌酸、丙氟哌酸、氯霉素、先鋒霉素V

6、為極度敏感，復(fù)方新諾明、諾氟沙星為高度敏感。針對App-S7型菌株，藥物諾氟沙星為極度敏感，氟哌酸、丙氟哌酸、氯霉素為高度敏感。
　　五、自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素的生物信息學(xué)分析
　　以Genbank所報(bào)道的App-S5b型自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素基因Adh進(jìn)行核酸序列比對及遺傳進(jìn)化的分析，同時(shí)，采用生物軟件及在線生物數(shù)據(jù)庫分析該蛋白的基本特征如信號肽、分子信號通路等。結(jié)果顯示，Adh蛋白由3154個(gè)氨基酸組成，蛋白理論分子量為316.70 KDa