自身免疫甲狀腺炎患者甲狀腺細(xì)胞DNA甲基化-羥甲基化的改變及碘的影響.pdf

1、目的:流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)高碘使自身免疫甲狀腺炎(Autoimmune Thyroiditis，AIT)的患病率和發(fā)病率升高，高碘作為促進(jìn)AIT的重要環(huán)境因素，可能是通過(guò)表觀遺傳學(xué)機(jī)制發(fā)揮促進(jìn)疾病的作用的。本研究擬從表觀遺傳學(xué)的角度，以DNA甲基化和羥甲基化為切入點(diǎn)，從DNA整體甲基化/羥甲基化、特定基因（ICAM1）啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化/羥甲基化、全基因組DNA甲基化譜三個(gè)層面，觀察甲狀腺細(xì)胞DNA修飾異常，并探究這些異常修飾在AIT中

2、的作用。在體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)中，研究高碘對(duì)甲狀腺細(xì)胞DNA甲基化/羥甲基化的影響。
　　研究方法:1.本研究納入35例女性AIT患者和35例性別年齡匹配的正常對(duì)照(NC)，收集研究對(duì)象術(shù)前盤清和甲狀腺標(biāo)本，采用等密度梯度離心法分離甲狀腺細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)染色Tg檢測(cè)分離純度。分離純度大于80％的甲狀腺細(xì)胞，提取DNA和RNA，用于檢測(cè)DNA整體甲基化/羥甲基化、特定基因(ICAM1)啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化/羥甲基化。納入4名女性AIT和

3、4名性別年齡匹配的NC，原代培養(yǎng)分離純化甲狀腺細(xì)胞，免疫熒光鑒定細(xì)胞Tg表達(dá)陽(yáng)性率，純度大于90％的用于DNA甲基化芯片檢測(cè)。2.Real-time PCR方法檢測(cè)ICAM1 mRNA表達(dá);采用EpiMark試劑盒，通過(guò)糖基化和MspⅠ/HpaⅡ酶消化，分辨DNA甲基化和羥甲基化，檢測(cè)ICAM1基因啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化和羥甲基化水平，檢測(cè)位點(diǎn)分別位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（Transcription Start Site，TSS）上游-937

4、bp、-701 bp、-226 bp、-65 bp處;焦磷酸測(cè)序?qū)CAM1基因DNA甲基化水平進(jìn)行驗(yàn)證，檢測(cè)位點(diǎn)分別為TSS上游-708 bp、-701 bp、-692 bp、-690 bp、-688 bp和-226bp處。2.利用Epigentek的ELISA試劑盒，檢測(cè)DNA整體甲基化和羥甲基化水平;Real-time PCR檢測(cè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和DNA羥甲基化酶TET1、TET2、TET3的

5、mRNA表達(dá)。3.另外納入的4例女性AIT患者和4例性別年齡匹配的正常對(duì)照，提取DNA，利用Infinium Methylation EPIC BeadChip850K芯片檢測(cè)全基因組DNA甲基化譜的改變，得到DNA甲基化差異基因后進(jìn)行GO分析和KEGG通路分析。4.使用無(wú)血清培養(yǎng)基、或濃度為1000U/ml的IFN-γ、或800μM羥基戊二酸(2-HG，DNA整體羥甲基化競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑)、或二者共同處理正常人甲狀腺細(xì)胞系Nthy-ori

6、3-1。ELISA法檢測(cè)DNA整體羥甲基化水平，驗(yàn)證2-HG抑制羥甲基化的作用;檢測(cè)IFN-γ對(duì)原代培養(yǎng)甲狀腺細(xì)胞和Nthy-ori3-1細(xì)胞系DNA整體羥甲基化的影響。Real-time PCR檢測(cè)各條件處理后ICAM1基因和IL6基因mRNA表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)甲狀腺細(xì)胞表面ICAM1蛋白水平，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清中IL6水平。5.為研究高碘在體內(nèi)對(duì)甲狀腺細(xì)胞DNA甲基化和羥甲基化的影響，本研究將4周齡NOD.H-2h4小鼠分為

7、高碘水喂養(yǎng)8周組(n=20)和正常對(duì)照組(n=20)，甲狀腺HE染色確定建模成功后，提取甲狀腺組織DNA和RNA，檢測(cè)ICAM1啟動(dòng)子區(qū)域TSS上游＃1（-546bp）、＃2(-428bp)、＃3（-246bp、-232bp）、＃4（-107bp、-84bp、-60bp）4個(gè)區(qū)域7個(gè)位點(diǎn)的甲基化與羥甲基化水平，ELISA檢測(cè)DNA整體羥甲基化水平，Real-time PCR檢測(cè)ICAM1、TET1、TET2、TET3基因mRNA表達(dá)。6

8、.使用不同濃度的碘在體外處理原代培養(yǎng)的甲狀腺細(xì)胞和Nthy-ori3-1細(xì)胞系，檢測(cè)ICAM1基因表達(dá)和DNA甲基化/羥甲基化、DNA整體羥甲基化水平及相關(guān)酶的mRNA表達(dá)。
　　研究成果:1.在AIT患者甲狀腺細(xì)胞中，觀察到ICAM1 mRNA表達(dá)升高，TSS上游-937 bp和-226bp的5-hmc水平在AIT組高于對(duì)照組，-937 bp、-701 bp、-226bp處5-mc水平在AIT組低于對(duì)照組，P＜0.05;相關(guān)分析

9、發(fā)現(xiàn)AIT患者甲狀腺細(xì)胞ICAM1基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平與mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。2.DNA整體甲基化/羥甲基化的研究發(fā)現(xiàn)，DNA整體甲基化在AIT組和NC組甲狀腺細(xì)胞中無(wú)差異，DNA整體羥甲基化在AIT組降低，P＜0.05;甲基化/羥甲基化相關(guān)酶mRNA表達(dá)未見(jiàn)明顯改變。3.DNA甲基化芯片共檢測(cè)866，895個(gè)CpG位點(diǎn)。計(jì)算分布在各個(gè)DNA元件上的比例，發(fā)現(xiàn)Upstream2000、CpG島甲基化低于20％的CpG位點(diǎn)比例增加;內(nèi)

10、含子、重復(fù)序列區(qū)域，DNA甲基化水平低于20％的CpG位點(diǎn)比例增加，同時(shí)DNA甲基化水平高于70％的位點(diǎn)比例也增加。差異DNA甲基化位點(diǎn)的分析，設(shè)置P＜0.05、β差值大于0.2的位點(diǎn)為差異位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)32，837個(gè)低甲基化位點(diǎn)和61，990個(gè)高甲基化位點(diǎn)。低甲基化位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因包括HLA-DQA1等已知在AIT患者甲狀腺高表達(dá)的免疫相關(guān)基因，高甲基化基因包括與甲狀腺細(xì)胞發(fā)育和甲狀腺激素合成密切相關(guān)的基因，如PAX5、PAX8、PAX9、

11、DUOX1等。高甲基化和低甲基化基因涉及的主要分子功能都包括蛋白結(jié)合、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等;主要位于細(xì)胞膜。低甲基化基因參與的生物學(xué)過(guò)程包括T細(xì)胞活化、免疫應(yīng)答、NF-kappaB通路、IFN-γ信號(hào)通路;高甲基化的基因涉及的生物學(xué)功能有甲狀腺細(xì)胞發(fā)育、甲狀腺激素合成等。KEGG通路分析還發(fā)現(xiàn)，低甲基化基因主要涉及細(xì)胞黏附功能、NF-kappaB通路等，并發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因與1型糖尿病相關(guān);高甲基化基因所在的主要細(xì)胞通路主要有T細(xì)胞受體活化通路、Erb

12、B信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路等。4.體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DNA整體羥甲基化在2-HG的抑制作用下約降低了50％，P＜0.05; IFN-γ刺激甲狀腺細(xì)胞未改變甲狀腺細(xì)胞DNA整體羥甲基化水平。2-HG單獨(dú)作用不能提高ICAM1和IL6基因的表達(dá)，但可以促進(jìn)IFN-γ作用下甲狀腺細(xì)胞的IL-6、ICAM1基因表達(dá)的升高，提示DNA整體羥甲基化水平降低促進(jìn)甲狀腺細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。5.以高碘促NOD.H-2h4小鼠甲狀腺炎模型研究高

13、碘對(duì)甲狀腺DNA甲基化/羥甲基化的影響，發(fā)現(xiàn)AIT組小鼠甲狀腺組織炎癥相關(guān)分子ICAM1、IL-6、CD40的mRNA表達(dá)水平升高，ICAM1基因啟動(dòng)子區(qū)域＃2和＃3區(qū)域羥甲基化水平有升高趨勢(shì)，甲基化水平有降低趨勢(shì)。DNA整體羥甲基化水平在AIT組小鼠甲狀腺組織中低于NC組，P＜0.05; TET酶mRNA表達(dá)的改變無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。6.在高碘作用于甲狀腺細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，高碘可以刺激AIT患者來(lái)源的原代培養(yǎng)甲狀腺細(xì)胞ICAM1基因表達(dá)

14、升高，但不增加來(lái)源于NC組的原代培養(yǎng)甲狀腺細(xì)胞和Nthy-ori3-1細(xì)胞系ICAM1基因表達(dá)。梯度濃度高碘處理使DNA整體羥甲基化都有一過(guò)性升高，24小時(shí)DNA整體羥甲基化水平開(kāi)始降低;而10mM、100mM碘化鈉處理24小時(shí)，DNA整體羥甲基化仍維持在較高水平，原代培養(yǎng)的甲狀腺細(xì)胞中在1mM碘處理24小時(shí)后，DNA整體羥甲基化水平也有不同程度的升高。
　　結(jié)論:1.在AIT患者甲狀腺細(xì)胞高表達(dá)的ICAM1基因啟動(dòng)子區(qū)域觀察到了

15、DNA羥甲基化水平升高和甲基化水平降低，并發(fā)現(xiàn)甲基化水平與mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。2.AIT患者甲狀腺細(xì)胞DNA整體甲基化水平與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著變化，整體羥甲基化水平降低;DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、DNA羥甲基化酶(TET1/2/3)表達(dá)水平在AIT患者中未見(jiàn)明顯改變。3.AIT患者甲狀腺細(xì)胞甲基化譜與對(duì)照組相比，啟動(dòng)子上游2000bp范圍內(nèi)、CpG島低甲基化位點(diǎn)比例增加，內(nèi)含子區(qū)域低甲基化和高甲基化位點(diǎn)均增加，甲基化程度在30-70％的位

16、點(diǎn)比例減少;啟動(dòng)子區(qū)域低甲基化基因與T細(xì)胞活化、免疫應(yīng)答、細(xì)胞間黏附、NF-kappaB通路等功能相關(guān)，高甲基化基因與甲狀腺發(fā)育、甲狀腺激素產(chǎn)生等功能相關(guān)。4.體外實(shí)驗(yàn)降低DNA整體羥甲基化水平，能夠促進(jìn)IFN-γ刺激甲狀腺細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，協(xié)同刺激ICAM1和IL6的表達(dá)水平升高。5.0.05％NaI高碘水喂養(yǎng)8周的NOD.H-2h4小鼠甲狀腺組織DNA整體羥甲基化水平降低。6.高碘組NOD.H-2h4小鼠甲狀腺組織ICAM1 mRNA

17、表達(dá)水平升高，啟動(dòng)子區(qū)域可觀察到DNA甲基化水平降低和羥甲基化水平升高。7.高碘處理AIT患者來(lái)源的原代培養(yǎng)甲狀腺細(xì)胞，可使ICAM1 mRNA表達(dá)升高、啟動(dòng)子區(qū)域DNA羥甲基化水平有升高趨勢(shì)，甲基化水平有降低趨勢(shì);但高碘不能增加非AIT患者來(lái)源的原代培養(yǎng)甲狀腺細(xì)胞和Nthy-roi3-1細(xì)胞系ICAM1基因的表達(dá)。8.高碘體外處理原代培養(yǎng)甲狀腺細(xì)胞升高DNA整體羥甲基化水平，處理Nthy-roi3-1細(xì)胞系使DNA整體羥甲基化水平一過(guò)