佛波酯對DA化療方案增效減毒作用的研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia,AML）是一種常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，目前緩解治療AML主要通過使用各種細胞毒性藥物和造血干細胞移植。然而治療之后患者的總生存率不超過12％，高死亡率主要與治療相關的死亡、誘導化療失敗和早期的復發(fā)有關。因此，尋找能夠增加AML治療效果和減少其不良反應的藥物，對改善AML的治療具有重要的意義。
　　目前，在急性髓系白血病的化療方案中，以柔紅霉素

2、聯(lián)合阿糖胞苷為基礎的方案即DA方案是標準的誘導緩解治療方案，據(jù)報道，該方案治療18-60歲的患者的完全緩解率在65%-75%之間，長期的無病生存率為30%左右，劑量增加的誘導化療能提高療程的完全緩解率和緩解質量，但相關毒性亦隨之增加，在誘導治療過程中患者的死亡率為5%-10%。長期使用后出現(xiàn)的耐藥性和嚴重的不良反應制約著其在臨床上的發(fā)展和應用。
　　12-氧-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯（12-O-tetradecanoylpho

3、rbol-13-acetate，TPA）是一種有效的蛋白激酶C（PKC酶）激動劑，它通激活PKC調節(jié)細胞信號轉導通路，影響細胞的增殖、分化、存活和凋亡。據(jù)文獻報道，TPA對多種白血病細胞有很強的抑制增殖、誘導分化作用，而且增加白血病細胞對化療藥物的敏感性。除此之外，TPA可以快速恢復骨髓抑制患者外周白細胞數(shù)如中性粒細胞數(shù)。在治療白血病方面TPA已獲準進行II期臨床試驗。因此本實驗欲考察TPA聯(lián)合DA方案是否會影響用藥的有效性和安全性，通

4、過體外細胞實驗觀察TPA聯(lián)合DA方案對人白血病K562、HL-60細胞增殖抑制的影響，以及體內動物實驗觀察TPA對DA化療方案引起的不良反應影響。
　　方法：
　　1.TPA聯(lián)合DA方案對白血病K-562、HL-60細胞增殖的影響
　　1.1細胞培養(yǎng)人白血病細胞K562和HL-60用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃，5%CO2濃度，95%飽和濕度的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3天傳代1次。
　　1.2

5、MTT法檢測細胞增殖 MTT法檢測TPA和DA方案單用以及聯(lián)合作用后對白血病K-562、HL-60細胞抑制率的變化，繪制量效曲線，并進行統(tǒng)計學分析。
　　2 TPA對DA化療方案不良反應的影響
　　2.1TPA對DA化療方案所致昆明鼠死亡率的影響DA方案一次性大劑量尾靜脈注射柔紅霉素20mg/kg和阿糖胞苷500mg/kg，之后給予TPA25μg/kg治療，觀察TPA對DA方案所致動物死亡率的影響。
　　2.2TPA對

6、DA化療方案骨髓抑制的影響小鼠尾靜脈注射柔紅霉素6mg/kg和阿糖胞苷150mg/kg，連續(xù)給藥三天，建立DA方案小鼠骨髓抑制模型。一周之后尾靜脈注射TPA（12.5、25、50μg/kg），腹腔注射EPO500IU/kg，皮下注射GCSF10μg/kg，連續(xù)給藥三天，觀察TPA、EPO、GCSF能否減輕DA方案引起的骨髓抑制，比較各組外周血細胞計數(shù)的變化，并比較各組骨髓組織病理變化。
　　2.3TPA對DA化療方案心臟毒性的影響

7、小鼠尾靜脈注射柔紅霉素6mg/kg和阿糖胞苷150mg/kg，連續(xù)給藥三天，建立DA方案小鼠心臟損傷模型。一周之后尾靜脈注射TPA（6.25、12.5、25μg/kg），腹腔注射EPO500IU/kg，皮下注射GCSF10μg/kg，腹腔注射右丙亞胺150mg/kg，連續(xù)給藥三天，觀察TPA、右丙亞胺、EPO、GCSF對DA方案引起的心臟損傷是否具有治療作用，比較對各組血清CK-MB和心臟組織SOD、MDA的變化，并比較各組心臟組織病理

8、變化。
　　2.4TPA對DA化療方案腎臟毒性的影響在DA方案心臟毒性模型的基礎上，觀察TPA能否減輕DA方案引起的腎臟毒性，比較各組血清CRE、BUN、ALT、AST、TP、ALB、GLO和A/G的變化，并比較各組腎臟組織病理變化。
　　結果：
　　1.TPA對DA方案的體外增效作用
　　1.1TPA、DA方案單用對K562、HL-60細胞增殖的影響TPA、DA方案單獨作用K562細胞72h后，TPA的IC50

9、為2.12nmol·L-1，DA方案的IC50為DNR/Ara-c27.37nmol·L-1/136.85nmol·L-1；TPA、DA方案單獨作用HL-60細胞72h后，TPA的IC50為1.68nmol·L-1，DA方案的IC50為DNR/Ara-c17.94nmol·L-1/89.7nmol·L-1，均在較低的濃度就能對這兩種白血病細胞產生較強的抑制增殖作用。
　　1.2TPA聯(lián)合不同濃度的DA方案對K562、HL-60細胞

10、增殖的影響TPA（0.64nmol·L-1）可以顯著協(xié)同一定濃度范圍內的DA方案（2.76nmol·L-1-88.32nmol·L-1）對K562細胞增殖的抑制作用，DA方案單用的IC50為DNR/Ara-c27.37nmol·L-1/136.85nmol·L-1，當TPA與DA方案聯(lián)合應用時DA方案的IC50為10.16nmol·L-1/50.8nmol·L-1，與單用DA方案比下降了62.9%，有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。TPA（

11、0.32nmol·L-1）可以顯著協(xié)同一定濃度范圍內的DA方案（2.76-88.32nmol·L-1）對HL-60細胞增殖的抑制作用，DA方案單用的IC50為DNR/Ara-c17.94nmol·L-1/89.7nmol·L-1，當TPA與DA方案聯(lián)合應用時DA方案的IC50為7.08nmol·L-1/35.4nmol·L-1，下降了60.6%，有統(tǒng)計學差異（P<0.01）。
　　1.3不同濃度TPA聯(lián)合IC50濃度的DA方案對細

12、胞增殖的影響DA方案抑制K562細胞增殖的IC50為DNR/Ara-c27.37nmol·L-1/136.85nmol·L-1，DA方案抑制HL-60細胞增殖的IC50為DNR/Ara-c17.94nmol·L-1/89.7nmol·L-1，不同濃度的TPA聯(lián)合IC50濃度的DA方案同時作用于K562、HL-60細胞72h后，TPA對DA方案的增敏作用呈劑量依賴性，當TPA濃度高于0.32nmol·L-1時，TPA聯(lián)合DA方案的抑制率明

13、顯高于單用DA方案組和單用TPA組，有統(tǒng)計學差異（P<0.01）。
　　1.4高濃度TPA聯(lián)合DA方案對細胞增殖的影響臨床試驗發(fā)現(xiàn)，TPA8nmol·L-1是人體可以耐受的最大濃度，若高于該濃度將會發(fā)生寒顫、體溫升高等不良反應。因此選用該濃度TPA聯(lián)合不同濃度的DA方案觀察對K562、HL-60細胞增殖的影響。當DA方案濃度高于44.16nmol·L-1/220.8nmol·L-1時，TPA聯(lián)合DA方案對K562細胞的抑制率明顯升

14、高，與DA方案單用組和TPA單用組比，有統(tǒng)計學差異（P<0.01）。當DA方案濃度高于11.04nmol·L-1/55.2nmol·L-1時，TPA聯(lián)合DA方案對HL-60細胞的抑制率明顯升高，與DA方案單用組和TPA單用組比有統(tǒng)計學差異（P<0.01）。
　　2.TPA對DA化療方案不良反應的影響
　　2.1DA方案毒性試驗TPA能夠顯著降低DA方案引起的小鼠死亡，DA方案單用組動物的死亡率為61.5%，TPA聯(lián)合DA方案

15、組動物的死亡率為23.1%，與DA方案單用比下降了38.4%。
　　2.2TPA減輕DA方案引起的骨髓抑制建立DA方案骨髓抑制模型后予以TPA、EPO、GCSF治療，發(fā)現(xiàn)中劑量、高劑量TPA均可以顯著升高動物的體重，明顯升高骨髓抑制小鼠外周血白細胞數(shù)、紅細胞數(shù)、血小板數(shù)，與DA方案模型組比有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。其中TPA聯(lián)合EPO組對外周血細胞的作用最為顯著。HE染色結果顯示，TPA聯(lián)合DA方案組與DA方案單用組比，TPA

16、明顯改善骨髓組織的病理狀態(tài)，減少DA方案對骨髓組織的損傷。
　　2.3TPA減輕DA方案引起的心臟毒性建立DA方案心臟毒性模型后予以TPA、EPO、GCSF、右丙亞胺治療，發(fā)現(xiàn)中劑量、高劑量TPA均可以顯著升高動物的體重，顯著升高心臟系數(shù)和腎臟系數(shù)，顯著降低小鼠血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）和心臟組織MDA水平并升高心臟組織SOD水平，與模型組比有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。TPA明顯改善心肌組織的病理損傷，包括對心肌纖維萎縮，

17、脂肪細胞沉淀，心肌細胞水腫，淀粉樣變性跟DA方案模型組比有明顯的減輕。
　　2.4TPA減輕DA方案引起的腎臟毒性在DA方案心臟毒性模型的基礎上，發(fā)現(xiàn)TPA可以顯著降低血清谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、肌酐、尿素氮的水平，升高總蛋白、白蛋白的水平，并且改善腎臟組織的病理損傷。
　　結論：
　　1.TPA可以協(xié)同DA方案對K562、HL-60細胞增殖抑制的作用
　　2.TPA可以明顯減輕DA方案所致的骨髓抑制、心臟毒性和