納米顆粒的核酸遞送功能及安全應(yīng)用評價研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分進行論述：
　　第一部分 陽離子化明膠微球介導(dǎo)CXCR4 siRNA在腫瘤細胞中的RNA干擾研究
　　目的:RNA干擾(RNAi)對于人類基因相關(guān)疾病的治療，特別是抗腫瘤治療具有重要的意義。迄今RNAi的作用機理已經(jīng)非常明晰，并且有多種核酸藥物(siRNA、shRNA、miRNA、dsiRNA)和核酸遞送載體（病毒、脂質(zhì)體、陽離子聚合物、金屬或無機納米顆粒等）得到廣泛關(guān)注與研究。常用的核酸遞送載體主要包括

2、病毒載體和非病毒載體。病毒載體轉(zhuǎn)染率高，但存在核酸裝載量有限以及具有免疫原性和安全性風(fēng)險等問題;非病毒載體安全、穩(wěn)定，但轉(zhuǎn)染效率相對較低。因此，構(gòu)建安全、高效的非病毒核酸遞送載體是RNAi技術(shù)研發(fā)中面臨的一個重要挑戰(zhàn)。明膠來源于動物的皮膚和骨骼，可生物降解，并具有生物相容性好和易被化學(xué)修飾等特點，是制備藥物載體的一種重要生物材料。本課題的總體思路是合成陽離子化明膠分子，對傳統(tǒng)兩步溶解法進行改進，制備出尺寸分布均一的陽離子化明膠微球(ca

3、tionic gelatin nanoparticles，CGN);其目的是保護核酸物質(zhì)免于核酸酶降解，同時，實現(xiàn)核酸藥物緩釋而延長其作用時間。通過細胞實驗探究陽離子化明膠分子的交聯(lián)度、培養(yǎng)基中血清濃度以及細胞種類等因素對陽離子化明膠微球介導(dǎo)CXCR4 siRNA發(fā)揮干擾效果的影響規(guī)律。
　　方法:通過向明膠分子中導(dǎo)入乙二胺制備陽離子化明膠;以戊二醛為交聯(lián)劑，通過對傳統(tǒng)兩步溶解法進行改進來制備不同交聯(lián)度的陽離子化明膠微球(CGN)

4、，并以非陽離子化明膠微球(gelatin nanoparticles，GN)作為對照。采用掃描電子顯微鏡(SEM)、原子力顯微鏡(AFM)、動態(tài)光散射(DLS)等方法對CGN形貌、尺寸及其在水溶液中的水合粒徑、Zeta電位等參數(shù)進行表征和檢測。使用1％瓊脂糖凝膠電泳法檢測CGN與siRNA的結(jié)合，采用DLS法檢測CGN與siRNA復(fù)合物（CGN@siRNA）的水合粒徑和Zeta電位。采用CCK8法檢測GN、CGN、CGN@siRNA對小

5、鼠乳腺癌細胞4T1的細胞毒性，以及血清含量對細胞活性的影響。應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測CGN@siRNA的細胞攝取情況;通過激光共聚焦顯微鏡(confocal)觀察CGN@siRNA在細胞中的定位。采用Real Time PCR方法在腫瘤細胞株上檢測和評價交聯(lián)度、血清濃度以及細胞種類對CGN介導(dǎo)的CXCR4 siRNA干擾效率的影響規(guī)律。
　　結(jié)果:(1)制備了五種不同交聯(lián)度的CGN; SEM結(jié)果顯示，CGN為形貌規(guī)整的球形，尺寸均一;隨

6、著交聯(lián)度的增加，CGN的平均粒徑依次為488±103.17、412±67.93、328±68.34、297±64.80、280±72.08nm;在水溶液中，相應(yīng)的水合粒徑依次為652±10.61、533±2.83、375±7.07、367±7.08、358±3.54 nm; Zeta電位均在+40 mV左右，表明CGN表面帶正電。(2)凝膠電泳結(jié)果顯示，當(dāng)CGN與siRNA質(zhì)量比大于4以后，兩者能夠完全結(jié)合。(3) CCK8法檢測結(jié)果表

7、明，CGN對4T1細胞的毒性作用具有濃度依賴性和尺寸效應(yīng);而GN和CGN@siRNA的細胞毒性要低于CGN;另外，培養(yǎng)基中血清濃度降低會使CGN@siRNA的細胞毒性增大。(4)流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示，交聯(lián)度越大，CGN@siRNA進入4T1細胞的能力越強;血清濃度越低，越有利于細胞對CGN@siRNA的攝取;不同種類細胞對CGN@siRNA的攝取也各不相同。(5)Confocal觀察結(jié)果表明，CGN@siRNA進入細胞后主要分布在溶酶

8、體中。(6) Real time PCR檢測結(jié)果表明，CGN與CXCR4 siRNA復(fù)合物(CGN@siCXCR4)能有效沉默4T1細胞CXCR4的表達，干擾效率接近商用載體Lipofectamine3000;沉默效果可持續(xù)96 h，并與CGN交聯(lián)度相關(guān);降低培養(yǎng)基血清濃度有利于增強干擾效率;此外，CGN@siCXCR4在其他不同種類的腫瘤細胞中的干擾效果不同。
　　結(jié)論:陽離子化明膠微球可在多種腫瘤細胞株上有效介導(dǎo)CXCR4的R

9、NA干擾，并且基因沉默時間長，可實現(xiàn)siRNA的緩釋，是一種很有潛力用于抗腫瘤治療的siRNA遞送載體。
　　第二部分 納米銀對血管內(nèi)皮細胞的作用研究
　　目的:納米銀(AgNPs)優(yōu)越的抗菌性吸引了人們對食品、農(nóng)業(yè)、家用電器、紡織用品、醫(yī)療器械和環(huán)境保護等多領(lǐng)域產(chǎn)品的研發(fā)興趣。但是隨著在日常生活中的廣泛暴露，納米銀帶來的安全、環(huán)境和健康等問題也引起了學(xué)術(shù)界和相關(guān)監(jiān)管部門的密切關(guān)注。研究顯示，納米銀通過靜脈注射、口服、吸入等

10、暴露途徑進入生物體后，在心、肝、脾、肺、腎、腦、睪丸等器官中都有分布，主要通過作用于生物膜、誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS、損傷核內(nèi)DNA以及釋放Ag+等途徑抑制細胞生長或殺死細胞，由此導(dǎo)致全身毒性。目前關(guān)于納米銀對血管內(nèi)皮作用的研究主要集中在細胞毒性方面，關(guān)于其對血管內(nèi)皮細胞間相互連接的影響以及與銀離子細胞毒性機制的差異目前還不完全清楚。本課題在原代人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞上探究納米銀和硝酸銀對血管內(nèi)皮連接的影響以及兩者產(chǎn)生細胞毒性的機制差異，并采用尾靜

11、脈暴露方式觀察小鼠血管外周組織的病理改變，驗證兩者對血管內(nèi)皮完整性的影響及其所引起的全身毒性。
　　方法:本研究選用三種不同尺寸AgNPs（10、75、110 nm），初始濃度為1 mg/mL，表面由2 mM檸檬酸鈉包被，設(shè)AgNO3作為對照。在材料表征方面，采用透射電鏡(TEM)觀察AgNPs的形貌和尺寸分布;通過動態(tài)光散射(DLS)檢測AgNPs的水合粒徑和Zeta電位。在細胞實驗中，將原代人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)作

12、為研究對象，通過CCK8法檢測AgNPs和AgNO3對細胞活性的影響;利用Hoechst/PI雙熒光染色法觀察兩者引起的細胞凋亡和壞死情況;使用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）檢測HUVEC細胞內(nèi)銀元素含量，評價AgNPs和AgNO3的細胞攝取情況。采用TEM和能譜色散儀(EDX)對AgNPs在細胞內(nèi)的定位進行分析。通過激光共聚焦掃描電鏡(confocal)觀察AgNPs或AgNO3作用后細胞的鈣粘蛋白(VE-cadherin)和

13、肌動蛋白(Actin)表達水平，探究兩者對內(nèi)皮細胞間連接和細胞骨架的影響。通過流式細胞檢測儀和熒光顯微鏡檢測DCF的熒光強度，評價兩者引起的胞內(nèi)ROS水平改變。在體內(nèi)驗證實驗中，通過多次尾靜脈注射AgNPs或者AgNO3到小鼠體內(nèi)，收集小鼠肝臟、腎臟和肺組織，利用顯微鏡觀察AgNPs引起的病理改變情況;通過TEM觀察AgNPs在肝臟、腎臟和肺中的分布。
　　結(jié)果:(1)理化表征結(jié)果顯示，三種尺寸的AgNPs均呈顆粒狀分布，尺寸均一

14、;粒徑大小為11±1、76±6和107±8 nm。在水溶液中的水合粒徑分別為9.8±3.2、72.0±0.9、99.3±1.7 nm;在5％葡萄糖溶液中分別為10.7±3.3、78.9±0.9、116.8±2.6 nm;在完全培養(yǎng)基中靜置至48 h后，粒徑分別為12.6±3.9、104.6±0.2、147.0±1.7 nm，說明AgNPs能穩(wěn)定的分散在水溶液、5％葡糖糖以及完全培養(yǎng)基中。在水溶液中的Zeta電位依次為-42.3±1.4、

15、-45.5±0.7、-44.5±0.4 mV;在5％葡萄糖中依次為-35.7±0.1、-38.2±1.1、-37.7±0.6 mV;在完全培養(yǎng)基中靜置48 h后依次為-7.9±0.5、-8.0±1.1、-7.2±1.0mV，說明AgNPs表面均帶負電。(2) AgNPs的細胞毒性具有濃度依賴性和尺寸效應(yīng)，主要引起細胞凋亡;AgNO3的毒性作用明顯強于AgNPs，主要引起細胞壞死。(3)AgNPs能夠被HUVEC細胞大量攝取并且分布在溶酶

16、體中;而AgNO3不能被細胞攝取。(4) AgNPs作用于HUVEC細胞后使胞內(nèi)ROS水平顯著升高，能減少內(nèi)皮細胞間連接并且破壞細胞骨架完整性;AgNO3沒有引起上述現(xiàn)象。(5)抗氧化劑NAC提前處理細胞能降低AgNPs引起的胞內(nèi)ROS升高水平，削弱AgNPs導(dǎo)致的內(nèi)皮細胞間連接減少現(xiàn)象，降低AgNPs對內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的毒性作用。(6)多次尾靜脈注射AgNPs引起小鼠肝臟、腎臟和肺組織中血管周圍炎癥細胞聚集，產(chǎn)生明顯血管周圍炎癥反應(yīng)，而A