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文檔簡介
1、乙型肝炎已成為嚴重威脅人類健康的世界性疾病,也是當前我國流行最廣泛、危害最嚴重的一種疾病。中國是世界上乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染的高發(fā)區(qū),目前全國約有1億人為HBV攜帶者。乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)是HBV感染后第一個出現(xiàn)的血清標志物,已成為診斷HBV感染的重要指標之一。
核酸適體(aptamer)是一類新型的特異識別分子,被視為人工抗
2、體。但與抗體相比,核酸適體穩(wěn)定性好、沒有免疫原性和毒性、能通過化學合成制備以及修飾、特異性強和親和性高。這些優(yōu)點使它有望取代和超過抗體,在生物醫(yī)學以及化學分析等領(lǐng)域起著重要的作用。SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)技術(shù)即指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(shù),利用該技術(shù)可從人工合成的隨機單鏈寡核苷酸文庫中體外篩選出特異與靶物質(zhì)高度親和的核酸適體?;瘜W發(fā)光法具
3、有靈敏度高、線性范圍寬、操作簡單和易自動化等優(yōu)點,為疾病的分子檢測提供了一個良好的平臺。
基于磁性納米顆粒(magnetic nanoparticles,MNPs)的磁分離具有分離速度快、效率高、操作簡單、易實現(xiàn)功能化和自動化、以及不影響分離物質(zhì)的活性等優(yōu)越的物理化學性質(zhì)和生物相容性。納米金可以作為生物分子的載體,能迅速、穩(wěn)定地與核酸和蛋白質(zhì)等生物分子結(jié)合,而幾乎不影響這些分子的生物活性。而且以納米金作探針載體,可以在納米金上
4、負載多個信號分子,從而對目標靶分子的檢測信號進行放大。
本論文首先采用羧基化磁性納米顆粒為載體,SELEX篩選特異識別HBsAg的核酸適體,再將磁性納米顆粒、金納米顆粒、免疫分析、化學發(fā)光檢測和核酸適體技術(shù)等進行有機結(jié)合,建立了新的高靈敏、快速且經(jīng)濟實用的HBsAg檢測方法,為HBV感染的早期、快速檢測診斷奠定基礎(chǔ)。具體內(nèi)容包括:
1.納米顆粒的制備、表面修飾與表征
Fe3O4磁性納米顆粒的制備采用軟模板法
5、制備,再采用經(jīng)典St(o)ber法并經(jīng)改進后在Fe3O4顆粒表面包覆一層SiO2,形成Fe3O4@SiO2磁性納米顆粒。包硅后的Fe3O4@SiO2顆粒,需進一步與蛋白質(zhì)、核酸適體和金納米顆粒等結(jié)合,因此再對其進行氨基化、羧基化和巰基化等一系列表面化學修飾。金納米顆粒采用檸檬酸鈉還原法制備,并通過自組裝技術(shù)制備金磁復合顆粒。
所制備的Fe3O4顆粒呈圓形、大小比較均勻,粒徑為450 nm左右,分散性很好,但是表面比較粗糙;改進
6、后的方法所制備的Fe3O4@SiO2顆粒,在Fe3O4的表面清晰可見包覆有一層硅,表面變光滑,而且分散性良好;Fe3O4@SiO2顆粒具有很強的磁響應性,其磁飽和強度為43.86 emu/g;通過對Fe3O4顆粒、Fe3O4@SiO2顆粒、表面氨基修飾的Fe3O4@SiO2顆粒、以及表面羧基修飾的Fe3O4@SiO2顆粒分別進行Zeta電位測定,表明對Fe3O4顆粒的包硅、以及包硅后的氨基修飾和羧基修飾均很成功,為Fe3O4@SiO2顆
7、粒作為載體進一步與蛋白質(zhì)、核酸適體等物質(zhì)結(jié)合奠定了基礎(chǔ)。
所制備的金納米顆粒大小比較均勻,粒徑為15 nm左右,其Zeta電位為負值,峰值為-42.7 mv;巰基修飾的Fe3O4@SiO2顆粒與金納米顆粒通過共價鍵結(jié)合、自組裝為金磁復合顆粒,在SiO2表面吸附有許多金納米顆粒,但未形成明顯的核殼結(jié)構(gòu);Fe3O4@SiO2@Au復合顆粒磁性略微有所下降,但仍然具有良好的磁響應性,其磁飽和強度為36.42 emu/g。
8、2.不對稱PCR擴增條件的優(yōu)化
核酸適體SELEX篩選過程中,每一輪篩選均需使用單鏈寡核苷酸文庫與目標靶分子進行孵育,本論文采用不對稱PCR擴增制備單鏈DNA文庫,PCR反應體系為50μL。對Taq DNA聚合酶用量、上下游引物的比例、退火溫度以及擴增輪數(shù)等條件進行了優(yōu)化。優(yōu)化后的不對稱PCR擴增條件為:Taq DNA聚合酶用量1.5 U,上下游引物的比例90∶1,退火溫度68℃,擴增循環(huán)數(shù)30。以不對稱擴增的ssDNA產(chǎn)物經(jīng)
9、純化后作為下一輪篩選的文庫重復進行篩選,直至篩選結(jié)束。
3.以羧基化磁性納米顆粒為載體的HBsAg核酸適體的篩選
首先采用EDC、NHS兩步法活化羧基化磁性納米顆粒(Fe3O4@SiO2顆粒),然后將篩選靶分子HBsAg與活化后的羧基化磁性納米顆粒進行偶聯(lián),隨后與單鏈DNA文庫進行孵育,再經(jīng)過分離、洗脫和PCR不對稱擴增制備單鏈DNA文庫等過程篩選特異結(jié)合HBsAg的核酸適體。重復以上篩選過程,并對最后一輪篩選的產(chǎn)物
10、進行克隆、測序以及二級結(jié)構(gòu)分析。經(jīng)過13輪篩選,隨機挑選15個克隆進行測序,結(jié)果獲得3個特異結(jié)合HBsAg的核酸適體,分別命名為H01、H02和H03,其中大部分序列為H01,表明特異結(jié)合HBsAg的高親和性核酸適體篩選成功。而且在這3個核酸適體中,H01的親和性最高,故選擇H01進行下一步的HBsAg檢測應用。
4.基于磁分離和免疫分析的化學發(fā)光核酸適體傳感器的構(gòu)建及檢測應用
對篩選出的核酸適體H01進行氨基修飾,
11、然后固定在羧基化MNPs表面,再捕獲待檢測樣本中的HBsAg,磁分離后再分別與抗HBsAg的鼠一抗、堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)標記的馬抗鼠二抗孵育,最后磁分離獲得所述的核酸適體傳感器,用于催化AMPPD化學發(fā)光體系。
用該核酸適體傳感器對純HBsAg蛋白和乙肝血清樣本進行檢測,結(jié)果表明:在1-200 ng/mL范圍內(nèi),化學發(fā)光強度與HBsAg濃度具有良好的線性關(guān)系;通過利用正常血清、甲肝血清、
12、丙肝血清、以及甲、乙、丙肝混合血清作為對照,該核酸適體傳感器對乙肝血清中的HBsAg具有很高的特異性;并且,該傳感器對乙肝血清中的HBsAg的檢測限可達0.1 ng/mL,低于國產(chǎn)ELISA試劑盒的檢測限0.5 ng/mL。該核酸適體傳感器與ELISA試劑盒相比較,具有快速磁分離、檢測靈敏度高等優(yōu)點,因此在HBsAg的臨床檢測中具有一定的應用價值。
5.基于雙功能化金納米顆粒的化學發(fā)光核酸適體傳感器的構(gòu)建及檢測應用
13、上述構(gòu)建的基于磁分離和免疫分析的化學發(fā)光核酸適體傳感器不足之處在于磁性納米顆粒對化學發(fā)光具有遮蔽作用,為了克服這一缺點,我們又構(gòu)建了基于雙功能化金納米顆粒的化學發(fā)光核酸適體傳感器。用該化學發(fā)光核酸適體傳感器對純HBsAg蛋白和乙肝血清樣本進行檢測,結(jié)果表明:在1-225 ng/mL范圍內(nèi),化學發(fā)光強度與HBsAg濃度具有良好的線性關(guān)系;通過利用正常血清、甲肝血清、丙肝血清、以及甲、乙、丙肝混合血清作為對照,該核酸適體傳感器對乙肝血清中的
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