WHV表面抗原的制備及其在WHV表面抗體檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、目的：
　　WHV感染的土撥鼠/旱獺模型被廣泛用于慢性乙型肝炎的發(fā)病機(jī)理（包括免疫發(fā)病機(jī)制）研究、抗病毒藥物及治療策略的評(píng)估。然而WHV表面抗原（WHsAg）和表面抗體（WHsAb）的檢測(cè)還有待進(jìn)一步完善。本研究嘗試通過(guò)酵母真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)WHsAg并從WHsAg陽(yáng)性旱獺血清中分離純化WHsAg，探索WHsAg在WHV表面抗體檢測(cè)中的應(yīng)用。
　　方法：
　　1.構(gòu)建帶有His標(biāo)簽的WHsAg酵母表達(dá)重組質(zhì)粒PPIC3.

2、5K-WHs-His，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定證實(shí)，線性化WHsAg酵母表達(dá)重組質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)至GS115酵母菌，PCR篩選陽(yáng)性的酵母轉(zhuǎn)化子后，通過(guò)甲醇誘導(dǎo)WHsAg的表達(dá)，SDS-PAGE和Western-blot分析重組WHsAg的表達(dá)。
　　2.蔗糖密度梯度離心WHsAg陽(yáng)性的旱獺血清，通過(guò)ELISA檢測(cè)收集WHsAg陽(yáng)性組分；將WHsAg組分通過(guò)肝素親和層析柱，通過(guò)Bradford檢測(cè)收集蛋白陽(yáng)性組分；將蛋白陽(yáng)性組分經(jīng)過(guò)MIL

3、LIPORE脫鹽濃縮后經(jīng)瓊脂糖蛋白A柱吸附，通過(guò)SDS-PAGE分析IgG等免疫球蛋白去除的效果，獲得初步純化的來(lái)源于血清的WHsAg。以初步純化的WHsAg作為包被抗原，建立WHsAb間接ELISA檢測(cè)方法，將其初步應(yīng)用于WHV感染旱獺血清WHsAb的檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建了帶有His標(biāo)簽的WHsAg重組酵母表達(dá)質(zhì)粒PPIC3.5K-WHs-His，獲得WHsAg重組表達(dá)質(zhì)粒酵母轉(zhuǎn)化子GS115-PPIC3.

4、5K-WHs-His，通過(guò)甲醇誘導(dǎo)后未能在GS115胞內(nèi)和上清中檢測(cè)到重組WHsAg的表達(dá)。
　　2.通過(guò)蔗糖密度梯度離心、肝素親和層析和蛋白A吸附獲得血清來(lái)源WHsAg，經(jīng)SDS-PAGE分析可見(jiàn)p24和gp27WHV小表面抗原（SWHsAg）、p41WHV中表面蛋白（MWHsAg），在70KDa左右出現(xiàn)雜帶，可能為土撥鼠白蛋白條帶。以2.5μg/ml的純化WHsAg作為包被抗原，建立的WHsAb間接ELISA檢測(cè)法，能將WHs

5、Ag陰性旱獺血清的背景值從0.426降低至0.096，應(yīng)用于WHV感染旱獺血清WHsAb檢測(cè)能明顯減少假陽(yáng)性，提高了旱獺血清WHsAb檢測(cè)的特異性。
　　結(jié)論：
　　1.攜帶單拷貝WHsAg重組酵母表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至GS115酵母菌后未能誘導(dǎo)WHsAg的表達(dá)，下一步將嘗試通過(guò)調(diào)整酵母表達(dá)載體、酵母菌株及構(gòu)建多拷貝WHsAg酵母表達(dá)載體嘗試獲得真核表達(dá)的WHsAg。
　　2.通過(guò)密度梯度離心、肝素親和層析和蛋白A吸附成功獲得