基于鴨疫里黙氏桿菌表面抗原D15的乳膠凝集試驗(yàn)方法建立及其單克隆抗體的制備.pdf

1、目前，還未見到有關(guān)鴨疫里黙氏桿菌(RA)表面抗原D15截短蛋白的深入研究報(bào)道。本試驗(yàn)通過對(duì)本實(shí)驗(yàn)室在NCBI GenBank注冊(cè)的Riemerella anatipestifer D15基因（登錄號(hào)為CP003787）進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，對(duì)D15基因N端的主要抗原域進(jìn)行了克隆和原核表達(dá)、重組蛋白純化和多克隆抗體制備、檢測(cè)鴨疫里黙氏桿菌抗體的重組tD15蛋白乳膠凝集試驗(yàn)的建立、RAD15截短蛋白單克隆抗體的制備及初步鑒定，結(jié)果如下:

2、r>　　1.D15基因的生物信息學(xué)分析
　　通過對(duì)D15基因及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)、抗原性、功能位點(diǎn)以及稀有密碼子等進(jìn)行了全面的生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示RAD15基因包含2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，與多種黃桿菌屬同源蛋白的核酸和氨基酸序列具有較高的同源性。其編碼產(chǎn)物含有信號(hào)肽、1個(gè)跨膜區(qū)，可以定位于細(xì)胞外膜，抗原表位較多且在N端相對(duì)較多，不含有多個(gè)連續(xù)的稀有密碼子。
　　2.D15 N端基因的克隆、原核表達(dá)及多克隆抗體制備
　　在上述

3、分析基礎(chǔ)上克隆了該基因并利用原核表達(dá)系統(tǒng)pET-28a(+)，表達(dá)了部分ORF編碼產(chǎn)物（完整ORF編碼產(chǎn)物不表達(dá)），經(jīng)SDS-PAGE分析表明融合蛋白大小約為34 kDa，Western blot表明，表達(dá)產(chǎn)物可與兔抗RA全菌多克隆抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。采用Ni-NTA瓊脂糖凝膠層析柱純化重組蛋白，免疫動(dòng)物制備了RAtD15多克隆抗體，瓊擴(kuò)效價(jià)為1∶16。凝集實(shí)驗(yàn)表明制備的抗血清能與RA CH-1株全菌發(fā)生特異性反應(yīng)。
　　3.

4、檢測(cè)鴨疫里黙氏桿菌抗體的重組tD15蛋白乳膠凝集試驗(yàn)的建立
　　目前，還未見到通過建立構(gòu)建重組tD15蛋白乳膠凝集試驗(yàn)來檢測(cè)RA的研究報(bào)道。本試驗(yàn)采用Ni-NTA瓊脂糖凝膠層析柱純化pET-28a-tD15原核表達(dá)蛋白，以羧化乳膠為載體經(jīng)化學(xué)交聯(lián)法致敏乳膠，對(duì)致敏條件優(yōu)化后的乳膠進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。結(jié)果顯示在pH7.4的PBS緩沖液中，乳膠濃度為1％、蛋白質(zhì)量濃度為0.225 mg/mL、偶聯(lián)6h后制備的致敏乳膠凝集反應(yīng)最好;致敏乳膠抗

5、原無自凝現(xiàn)象;與鴨傳染性腫頭癥、鴨病毒性肝炎、鴨流行性感冒、鴨大腸桿菌病、鴨沙門氏菌病，鴨病毒性腸炎陽性血清不發(fā)生凝集;批內(nèi)重復(fù)、批間重復(fù)試驗(yàn)很穩(wěn)定;陽性血清的敏感性為1∶256。對(duì)比試驗(yàn)中建立的LAT方法與本實(shí)驗(yàn)室已建立的ELISA方法的符合率為80％，2種方法檢測(cè)的結(jié)果基本一致。研究結(jié)果表明，乳膠凝集方法具有操作簡(jiǎn)便、快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、價(jià)格低廉且可用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，是一種適合基層獸醫(yī)單位用于鴨疫里黙氏桿菌(RA)血清抗體檢

6、測(cè)的新方法。
　　4.D15截短蛋白的單克隆抗體的制備及初步鑒定
　　制備抗RA tD15蛋白的單克隆抗體并對(duì)其特性進(jìn)行鑒定。應(yīng)用純化復(fù)性的重組tD15蛋白免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0融合，應(yīng)用有限稀釋法篩選出抗RAtD15重組蛋白的陽性雜交瘤細(xì)胞株;采用腹水誘生法制備單抗腹水，用飽和硫酸銨法純化腹水抗體;采用間接ELISA法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞以及測(cè)定單克隆抗體的特性、效價(jià)及其相對(duì)親和力。獲得2株抗RA

7、tD15蛋白的陽性雜交瘤細(xì)胞株，命名為4＃、16＃，2株細(xì)胞株經(jīng)反復(fù)凍存復(fù)蘇，體外傳代仍能穩(wěn)定分泌抗體;4＃單克隆抗體屬于IgG1，κ鏈;16＃單抗單克隆抗體屬于IgG2b，κ鏈;4＃雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)為1∶3200，腹水效價(jià)為1∶12800，16＃雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)為1∶6400，腹水效價(jià)為1∶204800;2株單克隆抗體均能夠識(shí)別大小約為34 kDa的蛋白，說明兩種單克隆抗體是特異性識(shí)別tD15蛋白的抗體;兩種單抗能夠與鴨疫