新型光響應(yīng)性核酸遞送系統(tǒng)及其在siRNA遞送中的應(yīng)用研究.pdf

1、相較于病毒載體，陽離子非病毒載體由于其安全性高，易于修飾及成本低廉等優(yōu)勢受到人們青睞。然而由于溶酶體逃逸困難導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率較低是限制陽離子型非病毒載體在臨床上應(yīng)用的主要原因之一。通過光化學(xué)試劑幫助藥物從溶酶體中逃逸的技術(shù)被稱為光化學(xué)轉(zhuǎn)染(PCI)。利用短時(shí)間內(nèi)能夠產(chǎn)生大量活性氧(ROS)的光敏劑，在光照條件下，可以達(dá)到破壞溶酶體膜，在保護(hù)其它細(xì)胞器完整的條件下將藥物釋放的目的。C60由于其光化學(xué)特性及可修飾性強(qiáng)等特點(diǎn)，可以作為傳統(tǒng)光敏劑的

2、替代物，對其進(jìn)行修飾后依據(jù)PCI機(jī)制幫助載體實(shí)現(xiàn)溶酶體逃逸。本研究以此為出發(fā)點(diǎn)，分別構(gòu)建了陽離子化富勒烯-葡聚糖(C60-Dex-NH2)作為核酸載體以及陰離子化富勒烯-葡聚糖(C60-Dex-COOH)作為作為陰離子包覆材料。研究水溶性富勒烯通過體外光照，幫助復(fù)合物從溶酶體中逃逸，在體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)中對干擾效率的影響。
　　在保證復(fù)合物安全性的前提下，有效提高載體從內(nèi)涵體和溶酶體中的逃逸效率，我們制備了一種新型的核酸載體(C60-

3、Dex-NH2)。這種新型載體以水溶性多糖為骨架，以C60作為疏水性中心及光敏基團(tuán)。該載體系統(tǒng)可以利用簡單的體外的LED燈光照引發(fā)C60的光化學(xué)反應(yīng)，通過產(chǎn)生的活性氧破壞內(nèi)體膜，達(dá)到促進(jìn)核酸復(fù)合體從內(nèi)體及溶酶體中釋放的效果。材料學(xué)檢測中，用TNBS/elemental analysis，GPC和SSNMR(13C，HPDEC)對C60-Dex-NH2載體中氨基轉(zhuǎn)化率，分子量，化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征;凝膠電泳結(jié)合DLS/ELS對C60-Dex-

4、NH2結(jié)合siRNA的能力及C60-Dex-NH2/siRNA復(fù)合物的粒徑及表面電位進(jìn)行表征;細(xì)胞色素C檢測C60-Dex-NH2/siRNA復(fù)合物在光照條件下ROS產(chǎn)生情況。生物學(xué)檢測中用cck-8檢測復(fù)合物對MDA-MB-231細(xì)胞毒性;流式結(jié)合confocal檢測復(fù)合物進(jìn)入內(nèi)涵體及溶酶體并逃逸的過程及對MDA-MB-231-EGFP細(xì)胞的干擾效率;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，通過活體成像及取腫瘤勻漿的方式檢測C60-Dex-NH2/siRNA對4

5、T1-GFP-LUC2荷瘤小鼠的干擾效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在光照條件下，C60-Dex-NH2/siRNA復(fù)合物能夠持續(xù)的產(chǎn)生活性氧ROS，破壞溶酶體膜，幫助復(fù)合物從溶酶體中逃逸。在體內(nèi)試驗(yàn)中光照組對MDA-MB-231-EGFP細(xì)胞干擾效率達(dá)到53.02％，在體外實(shí)驗(yàn)中對4T1-GFP-Luc2荷瘤小鼠高劑量光照組干擾效率能夠達(dá)到69.05％。
　　為了進(jìn)一步驗(yàn)證在不同體系中水溶性C60均能夠起到光敏劑的作用，以及探究陰離子包覆層

6、對陽離子化高分子載體在血清環(huán)境中抑制血清蛋白吸附的作用。我們設(shè)計(jì)合成了羧基化葡聚糖(Dex-COOH)和羧基化葡聚糖修飾富勒烯(C60-Dex-COOH)兩種陰離子化高分子，將其包覆精胺化普魯蘭與siRNA形成的復(fù)合物(PS/siRNA)外部，以減少復(fù)合物對血清蛋白的吸附。通過DLS/ELS檢測陰離子包覆前后復(fù)合物的顆粒粒徑及Zeta電位;用QCM-D驗(yàn)證陰離子包覆層的形成并評價(jià)其對牛血清白蛋白(BSA)吸附量的影響;使用cck-8試劑

7、、流式細(xì)胞術(shù)檢測包覆前后及不同包覆比例下復(fù)合物的細(xì)胞毒性、進(jìn)入細(xì)胞的情況及對Hela-EGFP細(xì)胞的干擾效率。結(jié)果表明，Dex-COOH與C60-Dex-COOH能夠在PS/siRNA外部形成穩(wěn)定的負(fù)電性包覆層，有效阻止BSA的吸附，并在無血清的條件下顯著降低復(fù)合物的細(xì)胞毒性;在有血清環(huán)境中，表面包覆了陰離子化高分子的復(fù)合物可以不受血清蛋白的影響而被細(xì)胞大量攝取。對包覆了C60-Dex-COOH的PS/siRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染組施加光照，可