自組裝納米乳液的構(gòu)建及其在紫杉醇遞送中的應(yīng)用研究.pdf

1、目的：
　　據(jù)統(tǒng)計，疏水性藥物在已有的藥物遞送系統(tǒng)(Drug Delivery System，DDS)中占40％-60％，而在新發(fā)現(xiàn)的具有療效的化合物中，疏水性化合物的比例約為70％，此外，40％的活性化合物因為其水溶性差，無法制備成合適的劑型，因而被放棄研究。提高疏水性藥物的溶解度，將具有療效的化合物制備成合適的劑型是藥劑學(xué)中急需解決的問題之一。紫杉醇在臨床上主要作為治療進(jìn)展期卵巢癌的一線藥物被廣泛使用，但其疏水性極強(qiáng)，臨床上常

2、用的紫杉醇注射液采用聚氧乙烯蓖麻油增溶。由于聚氧乙烯蓖麻油會引起機(jī)體嚴(yán)重的超敏反應(yīng)，在給予紫杉醇注射液之前要進(jìn)行抗過敏處理，給藥步驟繁瑣，毒副作用強(qiáng)且患者依從性差;因此，通過其他遞送系統(tǒng)解決該問題具有重要的臨床應(yīng)用價值。另一方面，大量研究表明納米乳給藥系統(tǒng)具有增加難溶性藥物溶解度、保護(hù)藥物免受氧化或水解、增加藥物穩(wěn)定性、增加藥物在胃腸部位的滯留時間、提高疏水性藥物的生物利用度等優(yōu)點，是增加難溶性藥物口服生物利用度的的理想劑型。但目前廣泛

3、研究的納米乳，制備時需要大量使用乳化劑和助乳化劑，存在一定的安全隱患，且必須采用高能分散方法得到小粒徑的納米乳。
　　基于上述問題，本課題提出以自組裝法構(gòu)建納米乳液，將其作為疏水性藥物紫杉醇的新型遞送系統(tǒng)，期望增加紫杉醇的溶解度與生物利用度，進(jìn)而提高療效。為此，首先合成了一段為聚乙烯醇(PEG)，另一段含有β-環(huán)糊精(β-CD)的親水性嵌段共聚物PEG-P[Asp(PPA)CD]，利用其中3-CD與芐醇的主-客體作用自組裝制備水包

4、油型納米乳液;結(jié)合紫杉醇在芐醇中的良好溶解性，得到載藥納米乳液。自組裝方式制備納米乳液時，不需要使用高濃度的乳化劑和助乳化劑，且制備過程簡便，給藥前不需要預(yù)處理，以此制備的載藥納米乳液能有效提高紫杉醇的口服生物利用度，提高療效的同時降低了副作用。
　　方法：
　　1.親水性共聚物PEG-P[Asp(PPA)CD]的合成
　　以三聚光氣活化天冬氨酸芐酯得到N-羧基-L-天冬氨酸-芐酯-環(huán)狀酸酐(BLA-NCA)，然后與分

5、子量5kDa的端氨基PEG共聚形成聚乙二醇-聚天冬氨酸芐酯共聚物(PEG-PBLA)，之后通過炔丙基胺的氨基反應(yīng)得到PEG-P[Asp(PPA)CD]，最后通過其與單疊氮基取代的β-CD間的‘點擊’化學(xué)反應(yīng)，得到親水性共聚物PEG-P[Asp(PPA)CD]。采用紅外、核磁等方法表征聚合物的結(jié)果，明確共聚物的組成。
　　2.自組裝納米乳液的構(gòu)建與表征
　　以PEG-P[Asp(PPA)CD]水溶液為水相，以芐醇為油相，通過簡

6、單的渦旋方式，利用β-CD與芐醇間的主客體作用在油水界面自組裝形成納米乳;同時考察不同油相體積對納米乳形成的影響。制備載藥納米乳時，將溶有紫杉醇的芐醇溶液渦旋分散于PEG-P[Asp(PPA)CD]水溶液中即可得到。通過激光共聚焦顯微鏡對其形態(tài)進(jìn)行表征，以激光粒度儀測定其粒徑、粒徑分布和多分散性指數(shù)(PDI)。
　　3.載藥納米乳液的穩(wěn)定性研究
　　將自組裝載藥納米乳液于4℃和37℃條件下保存，不同時間點通過激光粒度儀測定納

7、米乳的粒徑與PDI，高效液相色譜法(HPLC)檢測藥物含量的變化，同時觀察納米乳外觀的變化，以此評價其穩(wěn)定性。
　　4.自組裝載藥納米乳液的體外釋放
　　采用透析法對自組裝載藥納米乳液的體外釋放進(jìn)行評價，以pH7.4的PBS緩沖液為釋放介質(zhì)或模擬胃腸道環(huán)境下pH條件。不同時間點取樣，HPLC法檢測藥物含量。
　　5.自組裝載藥納米乳液的體外抗腫瘤活性
　　將人肺癌細(xì)胞A549與小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10與不同濃

8、度的載藥納米乳液共孵育24h后，通過MTT法測定細(xì)胞存活率以初步評價自組裝載藥納米乳的體外抗腫瘤活性。
　　6.自組裝載藥裝納米乳液的體內(nèi)藥代動力學(xué)研究
　　SD大鼠尾靜脈注射或口服載藥納米乳液后，不同時間點取血，通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測大鼠血液中的紫杉醇的濃度，并運(yùn)用DAS軟件分析其藥代動力學(xué)參數(shù)。
　　7.自組裝載藥納米乳液的體內(nèi)抗腫瘤療效研究
　　構(gòu)建裸鼠的A549移植瘤模型，待腫瘤大小約150mm3時給予藥物

9、治療，記錄其體重變化和腫瘤體積變化，14天后處死取腫瘤組織和臟器記錄其重量，并計算臟器指數(shù)，對主要的病理學(xué)切片進(jìn)行蘇木精-伊紅(H&E)染色分析，同時檢測血常規(guī)水平和主要生化水平。
　　8.自組裝載藥納米乳液的急性毒性評價
　　單次尾靜脈注射大劑量載藥納米乳液于昆明小鼠，觀察14天并記錄小鼠的體重變化情況。14天后處死小鼠，取主要臟器記錄其重量，并計算臟器指數(shù)。同時，進(jìn)行H&E染色病理學(xué)分析，同時檢測小鼠的血常規(guī)水平和主要生

10、化水平。
　　結(jié)果：
　　1.成功合成了親水性嵌段共聚物PEG-P[Asp(PPA)CD]，并通過核磁共振氫譜特征吸收峰與紅外吸收曲線對比證實得到了預(yù)期產(chǎn)物。
　　2.通過主-客體作用介導(dǎo)的自組裝法制備了水包油型納米乳液，激光粒度儀測得納米乳液的平均粒徑為12nm，PDI為0.26，激光共聚焦顯微鏡下觀察納米乳液外觀呈均勻球形，邊緣清晰。
　　3.為期兩個月的穩(wěn)定性試驗表明，自組裝載藥納米乳液粒徑、PDI及藥物含

11、量無明顯變化，穩(wěn)定性好。
　　4.自組裝載藥納米乳液在pH7.4條件下24h的累積釋放率為81.8％，前4個小時的累積釋放率為74.3％，在模擬胃腸道環(huán)境下24h的累積釋放率為77.9％，前4小時的累積釋放率為62.3％。
　　5.自組裝載藥納米乳液有較好的體外抗腫瘤活性，與A549細(xì)胞共孵育24h后細(xì)胞存活率為22.6％，而B16F10細(xì)胞共孵育24h后細(xì)胞存活率為10.0％。
　　6.大鼠口服或靜脈注射自組裝載藥納

12、米乳液均產(chǎn)生較高的血藥濃度：口服后自組裝載藥納米乳液的最高血藥濃度為4.22μg/mL，靜脈注射后自組裝載藥納米乳液的最高血藥濃度為16.22μg/mL。
　　7.口服或靜脈注射自組裝載藥納米乳液均能抑制A549移植瘤腫瘤的生長，具有較好的抗腫瘤活性。
　　8.自組裝載藥納米乳液有良好的安全性，毒副作用較低。
　　結(jié)論：
　　本課題成功地合成了親水性嵌段共聚物PEG-P[Asp(PPA)CD]，并通過主-客體介導(dǎo)