基于抗體多維數(shù)據(jù)的解析探討丙型肝炎病毒抗體親和力在病程中的動力學(xué)變化及與HLA多態(tài)性的關(guān)聯(lián).pdf

1、目的:采用抗體多維數(shù)據(jù)分析，建立HCV抗體親和力的檢測方法，并探討丙型肝炎病毒抗體親和力、物質(zhì)量及總活性動力學(xué)變化及其與病毒量、機體損傷程度以及疾病不同階段的聯(lián)系。HCV感染患者HLA-A，HLA-B，HLA-DRB1基因型別與疾病過程的聯(lián)系以及其作用機制。
　　方法:1、采用重組乙型肝炎疫苗反復(fù)三次皮下注射免疫兔子，第一次注射一周后采集兔子血清，獲得低親和力抗體動物血清;第三次注射兩周后采集兔子血清，獲得高親和力抗體動物血清，倍

2、比稀釋血清，采用雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附實驗測定anti-HBs。隨機收集臨床診斷為HCV感染患者血清106例，采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測法測定HCV抗體，PCR-熒光探針法檢測HCV-RNA，同時檢測ALT、AST、ALB等臨床常用檢測指標。根據(jù)ALT、AST水平以及HCV-RNA水平各分三組，比較分析組間抗體親和力、抗體總活性及抗體物質(zhì)量的變化。2、隨機收集臨床診斷為HCV感染患者血清328例，采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測法測定HCV抗

3、體，PCR-熒光探針法檢測HCV-RNA，同時檢測ALB。根據(jù)疾病階段分為慢性肝炎組和肝硬化組，慢性肝炎組又根據(jù)患者ALB和HCV-RNA水平分為:ALB正常&HCV-RNA陰性組(好轉(zhuǎn)恢復(fù)階段)和其他組(進展階段)。分析比較組間抗體親和力、抗體物質(zhì)量及抗體總活性的變化。3、隨機收集臨床診斷為HCV感染患者血清104例及健康對照200例，采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測法測定HCV抗體，PCR-熒光探針法檢測HCV-RNA，同時檢測血清ALB

4、水平，采用測序方法(Sequence based typing，PCR-SBT)進行HLA基因型的鑒定。比較分析不同HLA型別間ALB水平、抗體親和力、抗體物質(zhì)量及抗體總活性的變化。4、采用網(wǎng)上搜索數(shù)據(jù)庫結(jié)合Discovery Studio(DS)軟件來分析預(yù)測NS3和HLA-DRB1*09，HLA-A*02,HLA-A*33,HLA-B*58,HLA-DRB1*07,HLA-DRB1*13這6種HLA蛋白分子之間的相互作用。數(shù)據(jù)庫包括

5、美國國立醫(yī)學(xué)圖書館文獻檢索系統(tǒng)NCBI，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫PDB以及PROSITE數(shù)據(jù)庫。
　　結(jié)果:1、雌兔第1次免疫后血清抗體親和力為0.522，第2次為0.826，第3次為0.896;雄兔第1次免疫后血清抗體親和力為0.816，第2次為0.846，第3次為0.972，均呈逐漸升高趨勢，與抗體親和力成熟規(guī)律一致。2、ALT、AST正常組的抗體物質(zhì)量明顯低于任一異常組、均異常組(p＜0.05)，而抗體親和力則明顯高于任一異常組、均

6、異常組(p＜0.05)?？贵w總活性在三組中比較，均沒有顯著性差異(p＞0.05)。3、根據(jù)HCV-RNA水平，將ALT、AST均正常組(53例)進一步分組為HCV-RNA陰性組和HCV-RNA陽性組。HCV-RNA陰性組的抗體總活性、抗體物質(zhì)量均明顯低于HCV-RNA陽性組(p＜0.05)，而抗體親和力卻明顯高于HCV-RNA陽性組(p＜0.05)。4、HCV-RNA陰性組的抗體總活性、抗體物質(zhì)量均明顯低于低病毒載量、高病毒載量組(p＜

7、0.05)，而抗體親和力則明顯高于低病毒載量、高病毒載量組(p＜0.05)。5、以HCV-RNA陽性為因變量，抗體親和力、抗體物質(zhì)量和抗體總活性為自變量，進行l(wèi)ogistic回歸分析，HCV-RNA水平與抗體親和力呈負相關(guān)(p＜0.05)。6、ALB正常&HCV-RNA陰性組的抗體親和力明顯高于慢性肝炎其他組和肝硬化組(p＜0.05)，而抗體物質(zhì)量明顯低于慢性肝炎其他組和肝硬化組(p＜0.05)，抗體總活性在三組中比較沒有顯著性差異(p

8、＞0.05)。7、抗體親和力和抗體物質(zhì)量的ROC曲線下面積分別是0.816、0.811，均顯示了較高的診斷效能，明顯高于傳統(tǒng)的抗體檢測(ROC曲線下面積為0.581)。抗體親和力對于區(qū)分丙肝感染進展階段(HCV-RNA陽性)和好轉(zhuǎn)階段(HCV-RNA陰性)的最佳診斷臨界點為0.873，抗體親和力越高，病毒復(fù)制越少。8、ALB正常&HCV-RNA陰性組中，高抗體親和力(≥0.873)的比例明顯高于慢性肝炎其他組和肝硬化組p＜0.05)。9

9、、HCV-RNA(+)的血清被含有高親和力抗體的血清中和后，1gRNA明顯低于中和前的水平(p＜0.05)。10、在HCV患者和健康對照組中鑒定出8種HLA型別具有顯著性差異(p＜0.05)，分別是HLA-A*02，HLA-B*39，HLA-DRB1*09, HLA-DRB1*11, HLA-A*33, HLA-B*58, HLA-DRB1*07,HLA-DRB1*13。其中HLA-A*02,HLA-B*39,HLA-DRB1*09,H

10、LA-DRB1*11在HCV患者中陽性率明顯低于健康對照組，而HLA-A*33，HLA-B*58，HLA-DRB1*07，HLA-DRB1*13則明顯高于健康對照組(p＜0.05)，提示HLA-A*02，HLA-B*39，HLA-DRB1*09，HLA-DRB1*11為丙肝感染的抵抗基因，而HLA-A*33，HLA-B*58，HLA-DRB1*07，HLA-DRB1*13則是丙肝感染的敏感基因。11、在上述8種HLA型別中，血清ALB水

11、平在HLA-A*02，HLA-A*33，HLA-B*39，HLA-DRB1*07，HLA-DRB1*11，HLA-DRB1*13基因攜帶者與非攜帶者間并無差異(p＜0.05)，僅HLA-B*58和HLA-DRB1*09攜帶者與非攜帶者的ALB水平明顯不同，前者p=0.015，后者p=0.003，均＜0.05，但僅有HLA-DRB1*09在交叉驗證中仍然具有顯著性差異，p=0.017，說明HLA-DRB1*09不僅是丙肝感染的抵抗基因，還

12、在阻礙ALB水平下降及疾病進展的過程中起到保護作用。12、HLA-A位點基因頻率(高分辨)與抗體親和力呈正相關(guān)，提示基因頻率越高，抗體親和力越強。13、對攜帶HLA-A*02，HLA-B*39，HLA-DRB1*09，HLA-DRB1*11，HLA-A*33，HLA-B*58，HLA-DRB1*07，HLA-DRB1*13基因型別的患者進行抗體親和力、抗體物質(zhì)量以及抗體總活性的比較，由于HLA-B*39僅有1例陽性患者，HLA-DRB1

13、*11只有4例陽性患者，故不對此兩種基因型別進行比較。結(jié)果顯示，按抗體親和力排序，HLA-A*33＞HLA-B*58＞HLA-DRB1*07＞HLA-A*02＞HLA-DRB1*09＞HLA-DRB1*13。14、生物信息學(xué)角度的親和力分析結(jié)果是:HLA對HCV NS3的親和性排序為:HLA-B*58＞HLA-A*33＞HLA-DRB1*09＞HLA-DRB1*07＞HLA-A*02＞ HLA-DRB1*13。
　　結(jié)論:1.HC

14、V抗體多維數(shù)據(jù)解析方法成立，HCV感染患者抗體親和力、抗體總活性、抗體物質(zhì)量的變化有可能反應(yīng)肝細胞損傷及病毒載量的變化，具有一定的臨床應(yīng)用價值。2.HCV抗體多維數(shù)據(jù)解析發(fā)現(xiàn)，抗體親和力與病情聯(lián)系密切，優(yōu)于傳統(tǒng)實驗室僅檢測抗體總活性的方法。抗體親和力在疾病轉(zhuǎn)歸中可能有一定的指示作用，具有較高的診斷效能，高親和力抗體可能有利于疾病的好轉(zhuǎn)，測定抗體親和力將有助于臨床醫(yī)生判斷疾病的預(yù)后。3.HLA多態(tài)性與丙型肝炎發(fā)生發(fā)展過程及HCV抗體親和力