MTT法體外藥敏試驗在優(yōu)化的急性髓系白血病治療方案中的應用.pdf

1、目的:多藥耐藥是急性髓系白血病(AML)治療失敗最主要的因素，克服并逆轉(zhuǎn)耐藥是成功治療復發(fā)難治AML的關鍵所在。異常的DNA甲基化與白血病的發(fā)生發(fā)展密切相關，因此DNA甲基化成為抗腫瘤藥物的良好靶點。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的有效抑制劑地西他濱，對腫瘤細胞具有雙重影響，高劑量時可表現(xiàn)出細胞毒作用，加速細胞凋亡，低劑量時可以改變基因的表達模式，促進細胞的分化。目前已經(jīng)成功用于臨床高危MDS、老年AML的治療。并對復發(fā)難治AML的治療有一定的增敏及

2、逆轉(zhuǎn)耐藥的作用。本實驗旨在探討臨床治療AML常用化療藥物的體外藥敏實驗與臨床療效的關系，探索以地西他濱為主的聯(lián)合方案作用于耐藥髓系白血病細胞及復發(fā)難治AML原代細胞的作用機制及療效，優(yōu)化治療方案，指導臨床難治性AML治療。
　　方法:取2014-04至2015-01期間在河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院住院治療的48例AML患者骨髓液（初治43例、復發(fā)難治5例），所有患者均按臨床表現(xiàn)、骨髓形態(tài)學檢查、免疫學分型和染色體檢查符合AML診斷標準（

3、參照張之南，沈悌血液病診斷及療效標準，第三版，科學出版社）確診。利用MTT法評價43例AML患者原代細胞對常用化療藥物組合(DNR+Ara-C、THP+ Ara-C、MIT+ Ara-C、IDA+ Ara-C、HHT+ Ara-C)敏感性與臨床療效的相關性。結(jié)合白血病預后分層指標能有效地對白血病體內(nèi)療效及預后情況進行預測。選取地西他濱、柔紅霉素、阿糖胞苷單藥或者聯(lián)合作用對K562/A02耐藥細胞株的增殖影響，并通過復發(fā)難治AML原代細胞

4、進行驗證。所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism5.0(San Diego，CA，USA)軟件分析。化療藥物的抑制率以(X)±S表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗，多組均數(shù)間比較采用SNK檢驗，單因素分析、兩個率的比較采用卡方檢驗。多因素分析采用Logistic回歸分析。設定P＜0.05作為具有統(tǒng)計學意義的標準。
　　結(jié)果:
　　1、聯(lián)合用藥對初治AML原代細胞抑制率和臨床治療療效關系
　　1.16種單一化療藥物的IC50

5、值:高三尖杉酯堿0.45μg/ml，米托蒽醌0.88μg/ml，柔紅霉素0.49μg/ml，吡柔比星0.36μg/ml，去甲氧柔紅霉素0.25μg/ml，阿糖胞苷1.2μg/ml。
　　1.2臨床常用5種聯(lián)合方案對初治AML原代細胞的抑制率:高三尖杉酯堿+阿糖胞苷（HA方案）:敏感組（56.69±9.45）％、耐藥組（22.92±2.32）％;米托蒽醌+阿糖胞苷（MA方案）:敏感組（54.21±1.05）％、耐藥組(21.38±1

6、.40)％;柔紅霉素+阿糖胞苷（DA方案）:敏感組(53.59±11.21)％、耐藥組（22.83±1.85）％;吡柔比星+阿糖胞苷（TA方案）:敏感組（53.78±9.57）％、耐藥組（21.68±1.66）％;去甲氧柔紅霉素+阿糖胞苷（IA方案）:敏感組（60.78±11.28）％、耐藥組（21.16±1.68）％。
　　1.343例初治AML患者中，體外敏感者35例，體外耐藥8例，體外藥敏結(jié)果與體內(nèi)療效的關系為:S/S32例

7、，S/R3例，R/S1例，R/R7例，總符合率為90.70％，陽性符合率為91.43％，陰性符合率為87.50％，表明體外藥敏實驗對化療藥物的體內(nèi)療效有很好的預測價值。
　　1.4新鮮原代細胞與凍存復蘇后細胞抑制率的比較:采用臺盼藍拒染實驗統(tǒng)計43例AML患者的新鮮原代細胞及凍存復蘇后細胞的細胞活力。新鮮原代細胞的平均活細胞率為（96.69±1.39）％，復蘇后平均活細胞率為（79.09±6.02）％，兩者比較P=0.000，說明

8、經(jīng)過復蘇后的細胞較新鮮原代細胞活性下降。將各聯(lián)合用藥作用于復蘇后的細胞，MTT法測定其細胞生長抑制率，HA方案:敏感組（60.84±8.51）％、耐藥組（27.53±1.22）％;MA方案:敏感組（59.23±7.94）％、耐藥組（26.53±3.86）％;DA方案:敏感組（59.76±9.12）％、耐藥組（27.38±1.31）％;TA方案:敏感組（58.60±8.92）％、耐藥組（28.52±1.49）％;IA方案:敏感組（68.3

9、8±9.82）％、耐藥組（27.21±0.98）％，分別與新鮮原代細胞的抑制率進行比較，P＜0.05，化療方案作用于新鮮原代細胞與復蘇后細胞的抑制率比較差異有統(tǒng)計學意義。43例AML原代細胞復蘇后體外藥敏實驗結(jié)果與體內(nèi)療效的關系為:S/S32例，S/R10例，R/S1例，R/R0例，總符合率為74.42％。將新鮮原代細胞與復蘇后細胞體內(nèi)外總符合率進行比較，P＜0.05，兩者差異具有統(tǒng)計學意義。若將復蘇后細胞替代新鮮原代細胞進行體外藥敏實

10、驗，體內(nèi)外一致性受到影響，因此本實驗均采用新鮮原代細胞。
　　1.5根據(jù)體外藥敏實驗和臨床療效結(jié)果分為敏感組(S/S)及耐藥組（R/R），按照年齡（≥60歲）、白細胞計數(shù)(≥100×109/L)、危險度分層（低危、中危、高危）、是否緩解、是否復發(fā)進行單因素分析，結(jié)果提示體外實驗敏感組體內(nèi)緩解率高，復發(fā)率低，體外實驗耐藥組體內(nèi)緩解率低，復發(fā)率高，并且白細胞計數(shù)、危險度分層與化療敏感性及疾病復發(fā)有關(P＜0.05)。將單因素分析結(jié)果有

11、統(tǒng)計學意義的指標進行賦值，并進行Logistic多因素回歸分析，結(jié)果提示:危險度分層為患者對化療是否敏感及是否易復發(fā)的獨立危險因素。
　　2、單藥或聯(lián)合藥物對白血病K562/A02耐藥細胞株增殖的影響
　　2.1 MTT法檢測K562/A02耐藥細胞對阿霉素耐藥倍數(shù)的結(jié)果:阿霉素作用于K562/A02細胞24小時的IC50值為12.38μg/ml，作用于K562細胞24小時的IC50值為0.14μg/ml，兩樣本t檢驗示，K

12、562/A02細胞對阿霉素的敏感性低于K562細胞(P＜0.05)，K562/A02細胞的耐藥倍數(shù)是K562細胞的87倍，可繼續(xù)用于實驗。
　　2.2不同濃度單藥對K562/A02耐藥細胞株增殖的影響:不同濃度地西他濱作用于K562/A02細胞株48h，各組抑制率分別為（19.94±0.12）％、（34.05±0.11）％、（52.23±0.10）％、（60.10±0.07）％，實驗結(jié)果表明不同濃度地西他濱對K562/A02細胞增

13、殖有抑制作用，且呈劑量依賴性，隨著濃度的升高，抑制率逐漸升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。不同濃度柔紅霉素作用于K562/A02細胞48h，各組抑制率分別為(6.97±2.32)％、(15.10±1.93)％、(25.11±2.11)％、(30.52±1.76)％。不同濃度阿糖胞苷作用于K562/A02細胞48h各組抑制率分別為(9.20±2.68)％、（19.08±2.11)％、(25.39±1.75)％、(36.15±3.1

14、4)％。
　　2.3單藥及聯(lián)合藥物對K562/A02耐藥細胞株增殖的影響:分別計算出地西他濱的IC50值為0.77μg/ml，柔紅霉素的IC50值為7.57μg/ml，阿糖胞苷的IC50值為5.48μg/ml。地西他濱、柔紅霉素、阿糖胞苷各單藥作用于K562/A02細胞48h抑制率分別為（45.22±2.07）％、（26.82±1.94）％、（22.29±3.01）％。地西他濱+柔紅霉素作用于K562/A02細胞48h抑制率為（7

15、6.32±1.75）％，地西他濱+阿糖胞苷作用于K562/A02細胞48h抑制率為（79.02±2.30）％，柔紅霉素+阿糖胞苷作用于K562/A02細胞48h抑制率為（28.05±1.20）％。地西他濱+柔紅霉素處理組較柔紅霉素、地西他濱單藥處理組均有顯著差異(P=0.000)，地西他濱+阿糖胞苷處理組較地西他濱、阿糖胞苷單藥處理組均有顯著差異（P=0.000），地西他濱+柔紅霉素處理組、地西他濱+阿糖胞苷處理組均較柔紅霉素+阿糖胞苷

16、處理組有統(tǒng)計學差異（P=0.000）。
　　3、單藥或聯(lián)合用藥對復發(fā)難治性AML原代細胞增殖的影響
　　3.1單藥對復發(fā)難治AML原代細胞增殖的影響:地西他濱單藥處理5例復發(fā)難治性AML原代細胞的抑制率分別為:（40.95±3.42）％、（42.12±2.34）％、(40.91±3.26)％(40.14±3.20)％、(42.56±3.55)％:柔紅霉素單藥處理的抑制率分別為（20.25±2.84）％、（20.80±3.06

17、）％（21.19±3.57）％、（19.68±3.24）％、（20.87±4.18）％;阿糖胞苷單藥處理組的抑制率分別為(17.19±2.97)％、（17.30±3.20）％、（15.30±2.25）％、(17.36±1.72)％、(17.95±2.23)％。
　　3.2地西他濱為主聯(lián)合藥物對復發(fā)難治AML原代細胞增殖的影響:地西他濱聯(lián)合柔紅霉素處理5例復發(fā)難治AML原代細胞的抑制率分別為:(73.08±1.69)％、(72.80

18、±1.07)％、(73.88±1.71)％、(73.98±1.45)％、（73.15±2.12）％;地西他濱聯(lián)合阿糖胞苷處理的抑制率分別為:(75.78±3.06)％、(75.56±2.29)％、(74.55±2.87)％、（76.23±2.21)％、（75.66±2.52）％。柔紅霉素聯(lián)合阿糖胞苷處理的抑制率分別為:(27.06±1.82)％、(27.72±1.88)％、(27.70±1.63)％、（26.39±1.27)％、（25.

19、18±2.24）％。地西他濱+柔紅霉素處理組均較地西他濱、柔紅霉素單藥處理組有顯著差異(P=0.000)，地西他濱+阿糖胞苷處理組均較地西他濱、阿糖胞苷單藥處理組有顯著差異(P=0.000)，地西他濱聯(lián)合藥物處理組較柔紅霉素+阿糖胞苷處理組有顯著差異(P=0.000)。地西他濱、柔紅霉素、阿糖胞苷各單藥及地西他濱+柔紅霉素、地西他濱+阿糖胞苷、柔紅霉素+阿糖胞苷聯(lián)合用藥處理K562/A02細胞及難治原代細胞，兩樣本t檢驗表明，兩種細胞的

20、增殖抑制率存在顯著差異(P＜0.01)，說明K562/A02細胞對藥物的敏感性高于難治原代細胞。
　　結(jié)論:
　　1、體外藥敏實驗與臨床療效相關性好，對于耐藥患者可根據(jù)體外藥敏實驗結(jié)果選擇最佳化療方案，調(diào)整治療。
　　2、敏感組(S/S)臨床完全緩解率高，復發(fā)率低，耐藥組(R/R)臨床完全緩解率低，復發(fā)率高。危險度分層為患者對化療是否敏感及是否易復發(fā)的獨立危險因素。
　　3、地西他濱能逆轉(zhuǎn)耐藥細胞株K562/A0